NGS实验室建设和质控经验分享

乳腺癌易感基因（BRCA）是一种重要的抑癌基因，包括BRCA1和BRCA2。BRCA基因突变可增加乳腺癌、卵巢癌等相关肿瘤的发病风险，而且可以作为预测靶向治疗疗效的标志物，因此BRCA检测有着重要的临床意义。

下一代测序（next generation sequencing, NGS）技术以高灵敏度、高通量、多层面等优势是目前BRCA检测的最佳技术平台。随着高通量基因测序技术的逐渐普及，如何正确的建立NGS实验室并合理进行NGS检测得到准确可靠的结果成为临床关注的焦点。在此，我们有幸邀请到中山大学肿瘤医院分子诊断科主任邵建永教授为我们带来NGS实验室建设和质控经验的分享。

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NGS实验室建设及运行

NGS实验技术相对复杂、影响因素较多，实验过程处理不当也会导致检测结果异常。因此，一个严格有序、规范的NGS实验室建设是非常必要的。NGS实验室需要设立分区，各实验区域与缓冲间应有一定的通风压力差，保证合理的空气流向，防止污染。目前NGS实验室主要的功能区有试剂准备区、样本提取区、文库制备区、杂交捕获区、文库扩增区、测序分析区等。NGS实验室建设的基本原则是要最大限度的方便工作、最大限度的防治污染、最大限度的保护NGS测序仪器。

设立好实验室分区后还需要加强技术流程的规范操作。在本次报告中，邵建永教授结合自身临床实践，针对NGS实验室建设及运行中需要注意的一些细节做了介绍。关于设备与耗材，在文库制备室和杂交捕获室需准备固定使用的仪器，如PCR仪、金属浴、旋转混匀仪、磁力架等，避免仪器的来回挪动，也避免组织建库和血液建库的相互污染。

血液标本的采取及送检流程也要严格要求，采血及送检时间严格把控，合理选择采血管并进行相关操作人员的培训。在血液样本提取过程中，需选择标准的试剂框，确定合适的提取方法，摸索最佳操作步骤，对于不合格的样品要及时反馈，制定相关的SOP（标准操作流程）文件并严格按照相关的SOP流程进行操作。

对于NGS检测结果自动化分析流程的应用，需要我们在临床实际中进一步的评估和验证，对于自动化分析解读的结果需谨慎对待，需要进行严格的人工复核。

BRCA NGS检测全流程所有环节均可能会影响检测结果，NGS试验中需要做到全流程质控，包括样本获取及处理、核酸抽提的质控、文库构建质控、测序后质控等，所有质控数据均需做记录，一旦实验结果出现差错，可以据此寻根溯源，找到原因有效解决问题。

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NGS检测临床应用经验分享

NGS技术操作复杂，难点在于各个流程中的质控环节，由于NGS技术灵敏度较高，任何环节操作的误差都可能导致最后结果出现差错。从样本采集、病理质控到检测过程中的核酸质量质控和测序质量质控，直到检测后的结果注释及解读等，每一步的规范质控都十分重要。在本次报告中，邵建永教授针对NGS检测常遇到的问题也进行了分析和探讨。

临床NGS检测中如何选择目标基因Panel？选全基因组还是全外显子测序？邵建永教授指出测序基因Panel的选择取决于检测的目的，临床中常见的测序目的主要有治疗药物选择、疗效预测、预后判断和新型治疗靶点的检测等。现在有没有方法可以让医生方便地判断应该使用哪一种Panel？目前还没有确切的定论，这也是目前面临的问题和挑战，大量的研究和验证有待开展。对于指导现有特定靶向药物的使用，单基因进行测序即可满足需求；未来在有条件的情况下，可以选择全外显子测序，这样既可以满足临床治疗的需求，也可以满足从临床到科研转化的研发需求。

NGS如何实现不同突变类型与样本类型的最佳匹配？对于DNA碱基置换突变、小片段插入/缺失的检测可以使用组织样本、血液样本及循环肿瘤DNA（ctDNA）样本。对于DNA拷贝数扩增检测只适用于组织样本（肿瘤细胞含量大于60％），不适用于血液样本和ctDNA样本。对于DNA水平片段缺失，尤其是大片段缺失和杂合性缺失并不适合NGS技术进行检测。对于已知的融合基因检测，可以选取组织样本进行NGS检测，而NGS并不适合未知融合基因的检测。

最后，邵建永教授对本次报告做了总结：

NGS实验室建设布局的设计需进行前瞻规划、因地制宜、全盘思考。

对于NGS的检测流程需结合临床科研要求及自身实际不断进行更新，来更好的服务于临床。

NGS实验室运行相关的管理文件需要与时俱进、适时修改；相关的操作人员要重在执行、强化监督。

NGS技术的质量控制尤为重要，室间质量评价及实验室内部质量评估的进行。有助于确保临床NGS检测遵循质量管理体系进行操作，规范性和准确性达到国家标准。