囊胚滋养层细胞活检技术的优势及操作解析
作者：高英卓，杨大磊，冯迪，王秀霞，李达
作者单位：中国医科大学附属盛京医院生殖医学中心，辽宁 沈阳 110022
通讯作者：李达，电子信箱：[email protected]；王秀霞，电子信箱：[email protected]
1990年Handyside团队首次对携带不同X-连锁隐性遗传病基因的两对夫妇的胚胎进行了检测，筛选合适的胚胎性别并种植后顺利妊娠。如今植入前遗传学检测（PGT）技术已广泛应用于全世界的生殖中心并得到了迅速的发展。PGT技术是指在体外受精-胚胎移植技术的基础上，通过对配子或胚胎进行活检，获取部分遗传学物质进行染色体和（或）基因学检测，诊断其是否存在单基因缺陷、非整倍体或染色体拷贝数异常等，选择正常胚胎植入子宫，从而获得健康的子代。PGT技术的成功实施需要依赖可靠的活检技术获取可用于检测的胚胎遗传物质，而活检的过程对胚胎而言是一项侵入性的操作，活检是否成功将直接影响到PGT的最终结局。随着分子生物学技术的不断发展，虽然部分检测已经可以使用无创或微创的方式进行遗传物质的获取，但其检测结果的准确性尚存争议。因此，目前仍以有创方式获取遗传物质为主，即活检技术。PGT活检技术根据活检时间可分为极体活检、卵裂球活检与囊胚滋养层细胞活检：极体活检是在取卵当天（或受精后第1天）获取极体用于遗传学检测，可以检测母源性的染色体非整倍体和易位，但无法检测父源性遗传缺陷；卵裂球活检则是在受精后第3天（6~8个细胞阶段），获取1~2个细胞进行遗传学检测；囊胚滋养层细胞活检是在受精后第5天或第6天，胚胎发育至囊胚阶段时，获取5~10个滋养层细胞用于遗传学检测。
< h3>1 囊胚滋养层细胞活检技术的优势
1.1 胚胎损伤小 卵裂球活检是从6~8个细胞中抽取1~2个细胞用于遗传学检测，而囊胚滋养层细胞活检则是在数百个细胞中抽取5~10个滋养层细胞用于检测。已有证据表明，卵裂球活检可能会损害胚胎的发育潜能及种植能力。此外，卵裂球活检时，为了使卵裂球之间连接变得松散，需要利用无Ca2+/Mg2+的缓冲液处理胚胎，利用时差显微培养系统观察发现这一操作会延迟胚胎致密化和成囊过程，并降低种植率。滋养层细胞将来会发育成胎盘或胎膜，不直接参与胎儿形成。因此，滋养层细胞活检可有效避免损伤内细胞团，进而减小活检操作对胚胎发育的影响。
1.2 诊断准确性高 囊胚滋养层细胞活检用于遗传学检测的细胞数量（5~10个）远多于卵裂球活检（1~2个），提高了诊断准确性，降低了扩增失败的风险。
由于滋养层细胞活检技术自身的显著优势以及极体活检和卵裂球活检技术自身的局限性，结合近些年囊胚培养和囊胚冷冻技术的逐渐成熟，滋养层细胞活检技术已成为目前应用最为广泛的活检技术。
< h3>2 囊胚滋养层细胞活检技术的操作解析
根据活检策略不同，囊胚滋养层细胞活检技术可分为第3天胚胎孵化后活检方案、桑葚胚孵化后活检方案、囊胚当天孵化后活检方案和囊胚即时孵化后活检方案（图1）。
图1 囊胚滋养层细胞活检策略
2.1 第3天胚胎孵化后活检方案 2004年，de Boer等首次详细阐述了第3天胚胎孵化后活检方案（图1A）。胚胎培养至受精后第3天进行辅助孵化，使透明带形成开口，用来减弱透明带对胚胎的束缚作用，使胚胎更易于孵出。透明带开口位置应位于透明带与卵裂球之间存在间隙处或碎片处，避免损伤卵裂球。随后将胚胎继续培养至第5天或第6天，待部分滋养层细胞孵出后进行活检。
透明带开口主要有３种方法：化学法、机械法和激光法。化学法是利用酸性台式液（pH值2.2~2.6）溶解透明带。将装满酸性台式液的显微操作针对准透明带，通过喷洒台式液溶解透明带，使透明带形成开口。操作动作应熟练迅速，当透明带形成开口后，立即停止喷洒台式液，避免损伤卵裂球。机械法透明带开口是利用尖头的显微操作针刺破透明带。胚胎在持卵针固定下，操控显微操作针沿着透明带切线方向刺破并穿过透明带，随后松开持卵针，借助持卵针和显微操作针之间的摩擦使透明带开口。机械法操作快捷，然而其开口的大小具有不确定性。激光法是利用非接触式红外线（1.48μm）二极管产生的激光，将其对准并击打目标区域，使透明带形成开口。激光开口的大小和位置可以实现精确控制，且具有较强的可操作性和重复性，是目前最常用的透明带开口方法。
第3天胚胎孵化后活检方案实施起来相对容易，易于掌握，然而其也存在诸多弊端，例如：在受精后第3天实施辅助孵化后，由于透明带存在开口，破坏了囊胚腔扩张、透明带变薄这一正常发育过程，其对囊胚发育潜能的影响存在争议，有证据表明，卵裂期激光开口有可能降低胚胎发育潜能，改变胚胎表观遗传修饰；囊胚的孵出位置具有不确定性，如果内细胞团孵出，为避免活检损伤内细胞团，只能等到囊胚完全孵出再进行活检操作；在等待囊胚孵出过程中，需要反复观察胚胎状态，增加了对胚胎发育的干扰；如果第3天打孔的卵裂期胚胎未形成囊胚，那么之前的辅助孵化操作便成为徒劳。
2.2 桑葚胚孵化后活检方案 桑葚胚孵化后活检方案是指在受精后第4天，以透明带开口的方式对桑葚胚进行辅助孵化，随后胚胎继续培养至第5天或第6天，待囊胚孵出后，对孵出的滋养层细胞进行活检（图1A）。与第3天胚胎孵化后活检方案相比，其优势在于胚胎发生致密化之后，其形成囊胚的概率大大增加，可以明显减少活检人员实施辅助孵化的胚胎数量。如果胚胎发育速度较快，在取卵后第4天即可发育至早囊阶段，内细胞团的位置隐约可见，辅助孵化时可以避开内细胞团。然而，大多数情况下，此方法可能面临内细胞团孵出的风险，且仍需在培养过程中多次观察胚胎的发育状态。
2.3 囊胚当天孵化后活检方案 囊胚当天孵化后活检方案是在受精后第5天或第6天早晨，对囊胚进行辅助孵化（透明带开口），随后将囊胚放回培养箱继续培养，期间需要反复观察囊胚发育状态，直到囊胚孵出再进行活检（图1A）。此方案优点在于：策略相对简单，对活检人员要求较低。然而，由于辅助孵化后，囊胚孵出所需时间不确定，活检人员需要反复观察囊胚状态，大大增加工作量，尤其是对于工作量较大的胚胎实验室，显著降低了工作效率。另外，由于各个囊胚的孵出速度不同，活检人员可能需要分批次进行活检。然而，与第3天/桑葚胚孵化后活检方案相比，第5天或第6天的囊胚可以明确判断内细胞团的位置，实现有效控制辅助孵化的位置，避开内细胞团。
2.4 囊胚即时孵化后活检方案 囊胚即时孵化后活检方案是指受精后第5天或第6天，对完全扩张期囊胚进行透明带打孔，使透明带形成一个狭窄的孔道，随后立即用活检针沿透明带孔道吸取5~10个滋养层细胞用于遗传学检测（图1B~F）。已有证据表明，囊胚即时孵化后活检方案可取得更好的临床结局，其囊胚冷冻率、解冻复苏率、临床妊娠率均高于第3天胚胎孵化后活检方案。与囊胚当天孵化后活检方案相比，囊胚即时孵化后活检方案的优势在于无需提前辅助孵化，当囊胚发育至完全扩张的4期之后，可以随时在透明带打孔并立即进行活检，既能简化工作流程，又能节约时间。然而，由于囊胚的发育速度参差不齐，根据囊胚的不同特征，需要采取不同的活检方法，对活检人员提出了更高的要求。
近期，Yang等对不同特征的囊胚活检方法进行了全面、系统地总结，为囊胚即时孵化后活检方案的广泛应用提供了方法学基础。4期囊胚的活检：首先对囊胚进行人工皱缩，根据囊胚随后的皱缩状态（塌陷或未塌陷），采用不同的活检方法。如果人工皱缩后囊胚明显塌陷，在滋养层细胞与透明带剥离处（远离内细胞团），使用激光进行透明带打孔，利用活检针经孔道吸取5~10个滋养层细胞，随后将滋养层细胞切割下来（图1B）。如果囊胚未塌陷，可借助活检针经孔道向透明带内注入培养基，促使滋养层细胞与透明带剥离，后续操作与塌陷囊胚相同。5期囊胚根据形态可分为“花生形”和“8字形”。“花生形”囊胚的活检方式：首先在孵出区域的滋养层细胞连接处用激光击打使其皱缩，待囊胚皱缩回透明带后，持卵针控制住胚胎，在持卵针对侧的透明带进行人工打孔，经孔道用活检针吸取滋养层细胞（图1C）。“8字形”囊胚的活检方法相对简单，可直接吸取孵出滋养层细胞用于活检，后续操作参考4期囊胚。如果“8字形”囊胚的内细胞团孵出，先对位于透明带内部的滋养层细胞进行人工皱缩，之后的活检方法可参考4期囊胚（图1D）。6期囊胚的活检：直接利用持卵针固定囊胚（避免吸住内细胞团），利用活检针吸取滋养层细胞。需注意的是，活检之前转移6期囊胚时，应使用孔径较大的巴氏德吸管，避免挤压引起囊胚塌陷（图1E）。一旦囊胚塌陷，一方面细胞皱缩在一起，滋养层细胞不易被吸进活检针，增加了操作难度；另一方面，内细胞团与滋养层细胞紧紧包裹在一起，使得内细胞团的位置不易辨别，有可能在活检过程中误伤内细胞团。另外，对于接近完全孵出的囊胚，即只有小部分滋养层细胞残留在透明带里，应先将囊胚拽出透明带，随后的活检方法参考6期囊胚（图1F）。
滋养层细胞的切割方法有激光法和机械法：激光法是利用激光击打使滋养层细胞离断。滋养层细胞被吸进活检针里之后，一边牵拉滋养层细胞，一边用激光击打细胞，约3~5次激光击打之后，可离断滋养层细胞；机械法是利用活检针与持卵针之间的摩擦离断滋养层细胞。滋养层细胞被吸进活检针后，松开持卵针，将活检针移至持卵针的上缘，迅速向下移动活检针，即可离断滋养层细胞。近期，Yang等提出的“微激光-钝性切割方法”是将激光法与机械法有机结合，活检针吸取滋养层细胞并向外牵拉使其伸长，激光击打位于透明带外缘的滋养层细胞1~2次，随后利用机械法离断滋养层细胞，1~2次的激光击打有助于后续机械法切割滋养层细胞（图2）。此方法有效减少了激光击打次数，减小了激光带来的热损伤。
图2 “微激光-钝性切割方法”技术要点
< h3>3 囊胚滋养层细胞活检技术的争议
无论是通过IVF还是自然受孕，胚胎均可能出现嵌合体。嵌合体是指胚胎包含2种及以上的遗传学不同的细胞系，文献报道的嵌合体发生率从30%~90%不等。各个IVF实验室嵌合体发生率的差异受多个因素的影响，例如遗传学检测技术、非整倍体的界定标准、活检取材部位的选择以及实验室培养环境等。因此，关于囊胚滋养层细胞活检可靠性的争议，主要在于滋养层细胞的核型是否可以代表内细胞团的核型。诸多研究讨论了滋养层细胞活检和内细胞团活检诊断一致性的问题，诊断一致率为96.1%~100%。就目前的发展现状来说，囊胚滋养层细胞活检仍是最可靠的遗传学检测方法。另外，囊胚滋养层细胞活检技术的争议还包括部分PGT治疗周期患者可能由于无囊胚形成而取消周期。但随着IVF实验室培养技术的不断改进和完善，囊胚形成率也有所提高。胚胎经过自然淘汰所形成的囊胚数量虽然相对少，但更具发育潜能，并且在避免“无效”胚胎检测的同时也减轻了患者的经济负担。
综上所述，囊胚滋养层细胞活检技术是目前应用最广泛的活检技术。其中，囊胚即时孵化后活检方案无需提前辅助孵化，可灵活处理不同特征的囊胚，使胚胎免受打扰直至囊胚期，有效减小了活检操作人员工作量，简化了IVF实验室的工作流程。因此，囊胚即时孵化后活检方案有望成为最受欢迎的活检策略（参考文献略）
