结直肠癌与微卫星不稳定（MSI）的10个临床问题
微卫星不稳定（MSI）是指由于错配修复（MMR）蛋白缺失（dMMR）导致微卫星序列（通常由1~6个核苷酸为单位的串联重复DNA序列）复制错误不能被修复，当错误累积到一定程度即形成微卫星高度不稳定（MSI-H）。
目前在结直肠癌（CRC）诊疗中已常规开展微卫星稳定性检测，但其对CRC的临床指导意义部分尚存在争议。以下我们将提出并回答10个CRC与MSI的临床问题，以期能引发一些思考并提供临床参考建议。
01 哪些结直肠癌需要进行MSI/MMR检测?
目前越来越多的证据显示，无论家族史和发病年龄，对CRC患者进行林奇综合症（LS）的筛查有助于发现更多的LS患者，而MSI/MMR检测是筛查的重要手段；对于Ⅱ期CRC预后、高危Ⅱ期辅助治疗的选择，以及Ⅳ期CRC免疫治疗均有明确的指导作用。
虽然微卫星状态对Ⅲ期CRC的价值尚存在争议，但氟尿嘧啶单药辅助化疗不获益的结论对不能耐受含铂方案的患者仍有重要提示价值。因此，美国NCCN指南及美国胃肠病协会均建议对所有CRC无论年龄及分期，都应该进行MSI/MMR检测。
02 如何选择MSI/MMR的检测方法？
目前检测微卫星状态的方法主要有三种，包括免疫组化（IHC）、聚合酶链式反应（PCR）以及二代测序（NGS）。
2.1 聚合酶链式反应（PCR）
采用PCR方法比较肿瘤组织和正常组织DNA中重复核苷酸序列长度是最早确立检测CRC微卫星状态的分子手段，也是MSI检测的金标准。目前最常用的Bethesda标准由2个单核苷酸重复序列（BAT-25和BAT-26）和3种二核苷酸重复序列（D5S346，D2S123和D17S250）构成。
就Bethesda标准而言，五个位点中出现2个或以上的不稳定（Pentaplex panel出现3个及以上或更大panel中存在≥30%的重复不稳定序列）为MSI-H，存在1个位点（或更大panel中10%~30%的重复不稳定序列）为微卫星低度不稳定（MSI-L），而无不稳定位点（或更大panel中＜10%重复序列）则为微卫星稳定（MSS）。
既往研究表明MSI-L与MSS肿瘤生物学特点没有明显的差异，所以临床中通常将MSI-L与MSS归为一组微卫星稳定。虽然PCR是“金标准”，但由于不能提供准确的突变基因、实验周期较长等特点一定程度上限制了其临床的使用。
2.2 免疫组化（IHC）
免疫组化以其简便快捷的优势成为目前最常用的检测方式，通过使用相应抗体检测四种常见错配修复基因（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）在细胞核内表达的情况，明确是否存在错配修复功能缺陷。存在1种或以上蛋白表达阴性即为dMMR，相当于MSI-H；否则为错配修复蛋白完整（pMMR），相当于MSI-L/MSS。
IHC检测的MMR经过严格质控后可以达到与PCR检测90%~95%以上的一致率。另约有5%~11%的MSI-H CRC四个错配修复蛋白可以完整表达，其原因包括错配修复基因一些少见的错义突变（多为MLH1和MSH6基因）虽然影响其蛋白功能，而蛋白翻译和抗原性正常，仍能被抗体所识别，IHC检测实为“假阳性”；此外，由于错配修复系统的蛋白存在功能重叠（PMS2和PMS1、MSH6和MSH3），因此虽然蛋白表达缺失，IHC表现为dMMR，而PCR却显示MSS。免疫组化检测本身也存在主观性，且受检测抗体质量、检测过程（固定、染色）等因素影响，导致各中心的检测准确率高低不一。
2.3 二代测序（NGS）
随着高通量测序技术在肿瘤领域的深入发展，NGS也开始应用于MSI检测。对于CRC而言，同时进行MSI和RAS、RAF等靶向基因检测可以减少组织样本需求量。此外，检测肿瘤突变负荷（TMB）、胚系基因，并发现PCR不能测出的体细胞杂合性缺失突变以及其他基因结构突变导致dMMR，也是NGS的优势。
目前基于NGS检测MSI状态主要有两种方式，其一是通过全外显子测序检测TMB估测MSI状态，TMB高与MSI-H显著相关。另一种方式是通过选择一组位点的reads数目分布直接评估微卫星不稳定的程度（MSIsensor、mSINGS）。
上述方法都证实了其对MSI状态评估的准确性，甚至部分方法经过了免疫治疗临床试验的验证。来自浙江大学一项研究业已证实，相较于传统PCR检测，NGS-MSI（MSI-ColonCore）一致性高达99%。但目前NGS检测MSI尚缺乏统一的标准，对检测平台的仪器、技术和生信分析能力有着更高的要求，昂贵的测序费用也是临床医生必须考虑的问题。
因此，三种检测方法从临床需求来说，我们通常首选IHC或PCR检测；如果某些患者IHC或PCR检测提示为pMMR/MSS，但具有发病年龄早（＜50岁）、强烈的肿瘤家族史、右半黏液腺/印戒细胞癌、对常规化疗原发耐药等特殊情况，可考虑行NGS复核其微卫星状态避免漏诊。
03 同一肿瘤存在MSI/MMR的异质性吗?
虽然MSI被认为是CRC发生的早期事件，异质性小，但MSI作为免疫治疗疗效的预测指标，对帕博丽珠单抗和纳武利尤单抗的客观缓解率（ORR）通常小于50%（28%~52%），反映了该类肿瘤确实存在异质性可能。目前已有CRC中原发灶肿瘤内MSI异质性的个案报道，但似乎对免疫治疗没有明显影响，该结论可能还需大样本研究进一步证实。
原发灶和转移灶MSI的异质性数据也比较有限，大部分小样本研究均发现在肝、肺、远处淋巴结的转移灶与原发灶一致率较高（92%~100%），而腹膜及卵巢与原发灶一致率较低（分别为75%~78%、0%）。但另一项分析40例肠癌肝转移标本的回顾性研究中，原发灶与肝转移灶一致率为85%（34/40）。2018年ASCO公布的一项纳入331例CRC患者的研究显示，23例dMMR原发灶患者中26.1%转移灶检出pMMR，而308例pMMR原发灶中3.6%转移灶检出dMMR，该研究认为CRC原发灶与转移灶MMR状态存在差异。
总体来说，原发灶瘤内和原发灶与转移灶的MSI一致性比较高，通常对一处进行微卫星状态评估即可。但对于术后较长时间后才复发转移或经过多线多疗程治疗后的患者，如果情况允许，也可考虑再次活检评估微卫星状态。
04 液体活检可以在MSI/MMR检测中运用吗？
通过NGS检测外周血循环肿瘤DNA（ctDNA）的MSI（MSI from blood，bMSI）已逐渐崭露头角，这为晚期肿瘤患者标本取材困难或不足提供了新的解决办法。
在一项大样本（n=1145，近800例为CRC）对比循环DNA与组织DNA检测MSI的研究中，相较于组织MSI，bMSI达到98.4%的一致率和95%的准确率。另一项2019年在ASCO-GI公布的研究采用bMSISEA方法（NGS）通过ctDNA检测了87例CRC样本（43例MSI-H和44例MSS），当血浆ctDNA含量>0.4%时，检测灵敏度可达94.1%，准确性达97.7%；当血浆ctDNA含量>1%时，准确性可达到100%。此外，由北京大学肿瘤医院消化内科沈琳教授牵头的bMSI在以消化系统肿瘤为主的多中心临床疗效验证队列研究（IMPACT研究）业已进入数据分析阶段，结果值得期待。因此，对于肿瘤负荷大，ctDNA含量较高，而组织标本取材困难时，液体活检检测可考虑作为一种替代方法。
05 高危Ⅱ期MSI-H/dMMR结直肠癌是否应该行辅助化疗？
Ⅱ期CRC中，MSI-H/dMMR发生率约15%，是明确的孤立良好预后指标；氟尿嘧啶单药在Ⅱ期MSI-H/dMMR CRC辅助化疗不能获益。无高危因素的Ⅱ期MSI-H/dMMR CRC建议观察，但对于高危Ⅱ期CRC辅助化疗，MSI-H/dMMR预测作用仍存在争议。
一项结肠癌大样本MSI-H/dMMR研究（n=433）亚组分析显示，在高危Ⅱ期的MSI-H/dMMR患者（n=149）中，氟尿嘧啶联合奥沙利铂相较于单纯手术治疗有提高无疾病生存（DFS）的趋势（HR=0.13，P=0.06），而氟尿嘧啶与单纯手术治疗比较无显著DFS差异（HR=0.85，P=0.83）。另一项基于公共数据库的Ⅱ期结肠癌（n=3851）回顾性分析同样证实在具有高危因素的MSI-H/dMMR患者（n=1906）中，无论单药（HR 0.38，P=0.006）或联合化疗（HR 0.58，P=0.02），均能延长总生存（OS）时间。但也有研究认为即使在复发风险最高的pT4组中，MSI-H/dMMR患者单纯手术、单药及联合化疗对预后无显著性差异（P=0.691）。鉴于Ⅱ期MSI-H/dMMR辅助治疗的数据多来自于回顾性研究的亚组分析，且样本量有限，仍需要前瞻性研究进一步证实。目前NCCN指南建议高危Ⅱ期MSI-H/dMMR单纯观察，而CSCO指南建议行联合化疗。
总的来说，在免疫辅助治疗时代来临前，根据现有证据我们强烈推荐对高危Ⅱ期MSI-H/dMMR患者进行个体化的治疗决策。对于老年、体质偏弱或担心化疗相关不良反应的患者，可以选择定期观察随访；而对于包含多个高危因素、相对年轻且治疗积极的患者，在充分沟通获益和风险后，我们倾向可以考虑行3个月联合方案辅助化疗。
06 MSI/MMR状态对Ⅲ期结直肠癌有预后及治疗指导作用吗？
Ⅲ期CRC中，MSI-H/dMMR约占10%，这一分期患者微卫星状态的预后及预测作用均存在争议。部分研究认为Ⅲ期MSI-H/dMMR仍是预后良好的因素，也有数据显示MMR状态在Ⅲ期结肠癌中与预后无关。结合CRC的异质性，单一的标志物较难准确判断预后。近年来提出的以Ⅱ~Ⅲ期结肠癌为基础的结直肠癌共识分子分型（CMS）评分，其中MSI-H、BRAF突变等被归类于CMS1型（免疫型），该型在Ⅲ期CRC中预后较其他亚型更好。但MSI和BRAF对于Ⅲ期CRC与预后所占权重仍无定论，就目前的证据来说，在接受FOLFOX方案辅助化疗的患者中，MSS/BRAF突变型预后最差，MSI-H/BRAF野生型预后相对更好，而MSI-H/BRAF突变和MSS/BRAF野生型预后居中。此外，KRAS和左右半因素也应纳入协助判断。同时，2019年ESMO报道的一项研究显示术后ctDNA监测可以识别Ⅲ期肠癌高复发人群，综合多个因素的预测模型或许是未来预后、预测疗效探索方向。
就其预测作用而言，大部分研究支持氟尿嘧啶单药对MSI-H/dMMR结肠癌辅助治疗不获益的结论同样适用于Ⅲ期患者。而奥沙利铂在错配修复蛋白缺失情况下不影响其与DNA形成的螯合物发挥抗肿瘤作用。目前几项大型辅助治疗研究的汇总分析均显示在接受奥沙利铂为基础的联合方案辅助化疗的Ⅲ期CRC中，MSI-H/dMMR仍是一个预后良好的因素，且结合MSI-H/dMMR Ⅲ期患者3年内仍有近30%~50%复发的可能性，因此目前仍建议这部分患者行术后标准的联合辅助化疗。
辅助免疫治疗尚缺乏研究证据，目前正在进行的一项Ⅲ期随机对照研究（NCT02912559），拟入组700例Ⅲ期MSI-H/dMMR结肠癌患者，试验组接受6个月FOLFOX联合atezolizumab后使用atezolizumab维持6个月，以DFS作为主要终点，该项研究预计在2020年12月完成。对于局部分期非常晚的MSI-H/dMMR CRC患者（尤其是ctDNA阳性）是否是辅助免疫治疗最能获益的人群，我们期待研究结果的公布。
07 MSI-H/dMMR结直肠癌是否应该行新辅助免疫治疗？
对于新辅助治疗领域，FOxTROT研究对结肠癌患者进行6周FOLFOX±帕尼单抗新辅助化疗，术后病理显示dMMR患者肿瘤退缩反应明显差于pMMR患者（P<0.001），因此不推荐常规行新辅助化疗，但肿瘤最大程度退缩的时间、最佳化疗周期以及对dMMR合适的化疗药物需要进一步探索。此外，NICHE研究使用nivolumab（3 mg/kg，d1、d15）联合小剂量ipilimumab（1 mg/kg，d1）作为新辅助方案治疗Ⅰ~Ⅲ期结肠癌的初步结果显示，患者在治疗后6周内接受手术，其中dMMR患者（n=7）有57%（4/7）达到病理完全缓解（pCR），余下患者（3/7）残留癌细胞比例均≤2%。该项研究结果为新辅助免疫治疗提供了证据，但是否能转化为生存获益还需等待下一步的研究数据。同时，免疫治疗的不良反应也是是否行新辅助免疫治疗必须考量的因素。虽然免疫治疗单药3级以上不良反应发生率多<3%，致死性不良反应概率也较低（0.3-1.3%），但双免疫治疗时不良反应会明显增加。考虑到可切除MSI-H/dMMR CRC整体预后较好，是否还需行新辅助免疫治疗一定要慎重评估。
因此，我们推荐在多学科指导下，对于局部分期晚（如T4b）、肿瘤负荷大且需要联合脏器切除或者中低位直肠癌涉及保肛或肛周切缘阳性问题的MSI-H/dMMR患者，可以考虑尝试新辅助免疫单药治疗甚至联合免疫治疗。
08 MSI/MMR状态对Ⅳ期结直肠癌有预后及治疗指导作用吗？
8.1 预后评估
在转移性结直肠癌（mCRC）中，MSI-H/dMMR被认为可能是预后不良的指标，免疫检查点（PD-1、PD-L1、CTLA-4等）的表达抵消了免疫浸润对生存的积极影响可能是潜在的机制。但该结论也仍然存在争议，如CALGB/SWOG 80405研究认为，MSI-H/dMMR并不是Ⅳ期CRC的不良预后因素。
8.2 化疗疗效预测
两项早期小样本研究认为5-FU对mCRC治疗有效，但该结论并未得到后续研究的支持。一项多中心回顾性分析发现MSI-H/dMMR mCRC接受一线氟尿嘧啶单药有效率仅14%，因此5-FU对MSI-H/dMMR的mCRC可能是疗效不佳的。奥沙利铂与伊立替康对MSI-H/dMMR mCRC的疗效是目前另一个争议点。伊立替康为基础方案一线治疗MSI-H/dMMR mCRC回顾性研究亚组分析显示，患者反应率为72%；而奥沙利铂为基础的治疗反应率仅22%~33%。由于数据来自于不同研究的亚组分析，病例数有限，可比性较差。但如前文所述FOxTROT研究显示FOLFOX方案新辅助化疗的dMMR患者术后病理肿瘤退缩反应明显差于pMMR患者，因此该结果提示dMMR患者对奥沙利铂治疗反应相对不敏感。另外，一项多中心回顾性研究纳入284例MSI-H/dMMR CRC患者，FU为基础、奥沙利铂为基础以及伊立替康为基础的方案并未显示出对中位无进展生存（PFS）期（3.9个月、4.4个月和3.0个月，P=0.20）和OS期（17.9个月、16.8个月和23.9个月，P=0.14）的统计学差异，但似乎伊立替康相对更有优势。
8.3 靶向治疗疗效预测
对于目前mCRC批准使用的表皮生长因子受体（EGFR）抑制剂和血管内皮生长因子（VEGF）抑制剂而言，研究显示，MSI-H/dMMR肿瘤启动子甲基化引起EGFR配体减少，使EGFR抑制剂疗效降低；贝伐珠单抗可以通过抑制血管生成、血管正常化减少免疫抑制细胞，增强免疫反应，故贝伐珠单抗疗效可能优于西妥昔单抗。CALGB/SWOG 80405研究一线FOLFOX联合贝伐珠单抗或西妥昔单抗治疗mCRC，分析显示MSI-H/dMMR亚组中FOLFOX联合贝伐珠单抗优于联合西妥昔单抗（中位OS期为30个月对11.9个月），印证了上述结论。此外，虽然靶向药物在辅助治疗研究中为阴性结果，但NASBP C-08研究亚组分析发现Ⅱ~Ⅲ期CRC MSI-H患者FOLFOX+贝伐珠单抗优于化疗组。有限的研究的亚组分析显示VEGF抑制剂对MSI-H/dMMR肿瘤可能有一定应用前景。
8.4 免疫治疗疗效预测
MSI-H/dMMR是包括CRC在内的泛瘤种免疫治疗疗效预测指标。KEYNOTE-158研究纳入27种非CRC的不同部位肿瘤使用帕博丽珠单抗治疗分析显示，子宫内膜癌疗效最佳（ORR为57.1%，中位PFS期为25.7个月），胰腺癌相对较差（ORR为18.2%，中位PFS期为2.1个月），而颅内肿瘤对免疫治疗基本没有反应。同时，单CRC肿瘤对免疫治疗也存在疗效差异，说明MSI-H/dMMR单独作为免疫疗效预测仍未满足临床需求。
在MSI-H/dMMR CRC中，涉及免疫调节途径和抗原呈递途径的基因常常发生突变，导致免疫逃逸，这或许是部分MSI-H肿瘤对免疫治疗无效的原因之一。一项纳入22例经免疫治疗的MSI-H的mCRC的研究显示，TMB与ORR和PFS密切相关，所有高TMB患者（TMB＞41 Muts/Mb）疾病得到控制、中位PFS尚未达到（中位随访时间超过18个月）；而低TMB者（TMB ＜37 Muts/Mb）疾病控制率（DCR）仅33.3%、中位PFS期仅2个月，联合MSI与其他指标预测免疫反应可能更具有前景。
目前NCCN指南建议二线及以上或不能耐受强烈治疗的一线MSI-H/dMMR mCRC进行免疫治疗。在2020年ASCO GI公布的Checkmate-142研究一线使用纳武利尤单抗联合伊匹木单抗双免疫治疗MSI-H/dMMR CRC的ORR达到64%，相较于其二线以上的治疗结果仍有进一步提高（ORR为55%），可见免疫治疗夺取CRC一线治疗领地是必然的趋势。此外，纳武利尤单抗联合低剂量伊匹木单抗治疗（ORR为66%）似乎也是优于单药纳武利尤单抗（ORR为31.1%）或帕博丽珠单抗（ORR为33%）。因此，双免疫治疗也是“未来可期”的一种选择。
09 检测不同MMR基因的胚系突变对LS携带者有哪些意义？
LS是与遗传相关的一类疾病，以易患包括CRC、子宫内膜癌、胃癌等多种肿瘤和发病时间早为特点。LS是CRC致病机制之一，约占全部CRC的2%~4%。在LS的致病基因中，MLH1占42%，MSH2约占33%，MSH6占18%，PMS2约占7.5%；此外，位于MSH2上游的EPCAM基因也可通过导致MSH2甲基化进而导致LS，IHC表现为MSH2、MSH6蛋白缺失，比例约1%~3%。通常认为，检测到MLH1甲基化可基本排除LS，而在受精卵至胚胎早期阶段由非遗传因素导致的MLH1甲基化，仍可归于LS，并且该类型常常与年轻发病和多原发肿瘤相关，但这种情况极为罕见。
LS中不同MMR基因胚系突变导致的CRC终身患病风险也不同，其中MLH1和MSH2为30%~74%，MSH6仅10%~22%，PMS2为15%~20%。LS患者结肠癌切除术后10年内再次出现CRC的概率为16%~19%；接受全结肠癌切除术患者较部分切术患者生存期延长，但年龄越大获益越小。因此，对年轻、MLH1/MSH2胚系突变患者建议积极行全结肠切除。而MSH6和PMS2胚系突变是否需更激进地行预防性切除目前还存在争议。此外，CRC患者肠外肿瘤发生风险也明显升高，以子宫内膜癌最为常见，其他包括卵巢癌、胃癌、前列腺癌等；卵巢癌中，由MSH6突变导致的概率高达71%，MLH1和MSH2突变导致的发生率为54%，PMS2为15%，因此建议已生育或40岁以上女性行预防性子宫附件切除术也可能要考虑胚系突变是来源于哪个MMR基因。
LS的筛查意义更多在于对其近亲家属患病的及早发现，甚至预防。目前阿司匹林对CRC的预防作用已经大量研究。阿司匹林对照安慰剂可减小LS患者CRC发生率，但阿司匹林具体剂量和治疗持续时间尚有待进一步研究。2019年的AACR年会上公布的一项基于错配修复系统功能缺失导致染色体编码区微卫星序列移码突变的累积而产生移码突变衍生肽（FSPs）新抗原疫苗的Ⅰ/Ⅱa期研究结果显示：接种肿瘤抗原的LS小鼠模型，与未接种LS疫苗的小鼠相比，显著降低了肠道肿瘤负荷；与单纯接种相比，联合注射非甾体抗炎药萘普生，显著提高了LS小鼠的总体生存率。虽然仅是一项临床前研究，但该研究是开发LS患者预防肿瘤疫苗的第一步。
10 MSI-H/BRAF V600突变结直肠癌的治疗如何选择？
BRAF V600E突变在CRC中发生率约5%~10%。由于BRAF突变肿瘤与CpG岛甲基化相关，而后者可以引起MLH1启动子的失活，因而BRAF V600E突变和MSI-H/dMMR关系较为密切，且以散发型MSI-H/dMMR CRC为主，仅1.4%出现在LS中，通常对BRAF V600E突变的患者不再建议进一步行胚系突变的检测。研究显示，MSI-H/dMMR mCRC中BRAF V600E约占35%~50%，BRAF V600E突变的mCRC中约20%~55%为MSI-H/dMMR。
BRAF V600E突变CRC肿瘤有较高水平的CD8+肿瘤淋巴细胞浸润，预示着BRAF V600E突变型患者更可能从免疫治疗获益。KEYNOTE-164研究中，帕博丽珠单抗治疗在MSI-H/dMMR CRC的亚组分析显示：BRAF V600E突变组总缓解率达55%（5/9）；而在Checkmate-142研究中，双免疫治疗MSI-H/dMMR mCRC亚组分析显示BRAF突变患者的ORR和DCR达55%（16/29）和79%（23/29）；单纯从数值上比较，较联合BRAF V600E、EGFR和MEK抑制剂的两药或三药靶向治疗更高（靶向治疗ORR为12%~26%）。但BRAF突变的靶向治疗研究中未对MSI状态进一步进行亚组分析。
在黑色素瘤中，目前建议肿瘤负荷较大的BRAF V600E突变患者先进行BRAF V600E/MEK抑制剂达到快速缩小肿瘤目的，后进行免疫治疗，且基于BRAF V600E抑制剂有增强免疫反应的临床前试验结果，目前靶向联合免疫治疗的研究也在火热进行，并且取得了不错的结果。而靶向治疗在BRAF V600E突变的CRC疗效似乎没有那么出彩，因此对于MSI-H/dMMR伴BRAF V600E突变的CRC患者，我们更倾向于优先选择免疫治疗，进展后考虑多靶点靶向治疗。未来针对这个非常特殊的人群，免疫治疗和靶向治疗的使用先后顺序甚至联合使用都需进一步临床研究探索。
综上，MSI-H/dMMR是目前CRC全程管理中的重要指标分子标志物，无论是对患者的遗传筛查、预后和治疗决策的选择均发挥了重要作用，因此建议对所有CRC患者进行微卫星检测。同时，MSI-H/dMMR CRC还存在许多未知和争议，仍需在临床运用中和基础研究中不断探索。
