Nature 子刊深度综述：MET驱动突变实体瘤的诊断及靶向治疗
针对驱动基因变异的靶向药物为恶性肿瘤的治疗开启了划时代的篇章，靶向治疗因其独特的作用机制、突破性的疗效和较少的不良反应近年来一直是肿瘤药物研发最炽手可热的领域。除了广为人知的EGFR，MET也是备受关注的恶性肿瘤驱动基因，针对MET的靶向药物不断问世，但MET基因变异类型繁多，检测技术缺乏标准化的统一认识，时常让临床医师充满顾虑和疑惑。近日，Nature Reviews Clinical Oncology刊发了来自美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心MET研究领军人物Alexander Drilon教授的综述，详细阐述了MET基因异常改变（扩增，突变，融合等）的相关机制，检测方法以及相应的治疗策略，为临床医师开展针对MET的靶向治疗提供了系统而颇具价值的参考信息。
酪氨酸激酶受体c-MET（以下简称MET）失调是明确的恶性肿瘤发生驱动因素，随着检测技术的不断发展和研究的深入，不同类型的MET基因异常改变逐渐被识别。不同于EGFR等原癌驱动基因，不同类型的MET基因变异诸如扩增、突变、融合等均可导致恶性肿瘤的发生，不同的异变类型需要差异化的靶向治疗策略，这也解释了为什么过去只针对MET蛋白表达的患者实施靶向治疗效果欠佳。此外，这也给临床应用时的基因检测技术提出了更高的要求。
鉴于可供临床应用选择的MET抑制剂越来越多，因此明确某一肿瘤是否为MET基因驱动依赖至关重要。目前的泛概念抗MET治疗药物包括一系列抗MET/抗肝细胞生长因子（HGF）抗体及其抗体偶联药物（ADCs），多重激酶或选择性MET酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），这些药物部分已经在临床应用中显山露水表现不俗，部分在临床实验中已经展现出巨大潜力。譬如，最开始应用于MET变异的多重激酶抑制剂（涵盖MET）克唑替尼在MET 14号外显子（MET EX14）突变和MET扩增的肺癌患者中表现出良好疗效，而高选择性的新一代MET TKIs，包括卡博替尼、卡马替尼和沃利替尼等，更是对于特定的变异类型表现出了突破性的疗效。MET基因变异可见于两种情况，一种是原始（初级）MET基因驱动改变，肿瘤的发生仅仅依赖于MET信号通路的异常激活，另一种则为次级（继发）MET基因异变驱动型，肿瘤的生长依赖于MET基因和另一种驱动基因（如EGFR突变）同时发生改变，而MET异变为另一驱动基因突变的下游事件，此时MET基因的次级激活可以是自发的也可以是上游基因靶向药物（如EGFR TKI）诱导所致。
过去几年针对MET基因变异的靶向治疗得到了快速发展，这得益于两个因素：一是越发先进的诊断技术能够更好地鉴别MET驱动依赖的恶性肿瘤，二是针对这类肿瘤的药物研发快速跟进，并进行了大量前瞻性的临床研究。就在今年5月FDA批准了卡马替尼用于MET EX14跳跃突变的肺癌患者，这是首款被批准用于MET驱动依赖肿瘤患者的选择性MET抑制剂，具有里程碑式的意义，此外另一种选择性MET TKI卡博替尼也被FDA授予突破性疗法资格，同时在日本快速获批上市。MET变异类型繁多，药物的选择和疗效也和变异类型相关，然而目前MET基因的检测面临尚未解决的问题：不同的检测平台没有统一的标准化界定值，且目前没有一种能识别所有异变却又相对简单快捷的技术。
临床医师可能对于MET基因的变异分类、靶向药物的类别以及如何根据基因检测结果进行药物选择和预后判断等问题尚存疑惑。本文将会按照MET基因变异的几种类型（扩增、突变、融合、过表达）作为板块分类，分别介绍不同变异类型的分子生物学行为、基因检测方法及相应的治疗策略，此外还将探讨仅仅依靠MET过表达这一检测结果来决定治疗策略的局限性（最后部分我们会奉上诚意满满的纯干货）。
MET 扩增
MET扩增有多倍体（染色体重复）和局部扩增两种方式。当MET基因所在的7号染色体出现全基因组异常复制时就会形成多倍体，多倍体导致会除了MET基因拷贝数增加，也会导致位于7号染色体的其他原癌基因（包括EGFR、BRAF和CDK6）拷贝数平行增加。而局部扩增则不会伴随整条染色体的复制。MET局部扩增比染色体重复更能驱动恶性肿瘤的发生。这和乳腺癌的HER2基因比较类似，乳腺癌中如果是多倍体复制导致的HER2扩增，其细胞表型和HER2阴性乳腺癌细胞类似（即HER2无过表达）。在细胞模型中MET扩增可导致MET过表达、受体激活和不依赖配体的下游信号传导增强。
一、MET扩增的检测
目前有不同的方法可以检测MET扩增，这些技术包括荧光原位杂交（FISH）、实时定量PCR（qRT-PCR）和二代测序（NGS），二代测序对于肿瘤组织和来源于血浆及其他体液的循环DNA均可检测，遗憾的是不同的检测方法界定MET扩增的特异性临界值差别很大，尚无统一标准。
1、荧光原位杂交技术（FISH）：FISH是一种常用的检测技术，其基本原理是利用荧光基团偶联标记的DNA探针来识别特定序列的基因组区域，常用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片标本的检测。当待探测的基因组序列暴露于荧光标记的探针后，会发出相应颜色的荧光。荧光信号的数量则代表了了基因的拷贝数（见图1）。因为检测的细胞数目是已通过人工计数，因此根据总的信号值可以计算出每个细胞的平均信号值从而推测出目的基因的拷贝数，所以良恶性细胞的区分也是精确计算目的基因拷贝数的关键。FISH检测最常见的问题在于FFPE组织切片标本中细胞常出现“核截断”的情况，部分细胞荧光信号微弱，导致样本中可评估细胞的总数减少，尤其是在微小样本中，因此做好样本的质控非常重要。
FISH主要有两种主要方式来检测MET扩增。第一种方法直接测定MET基因拷贝数（GCN）。目前临床研究采用最多的为意大利学者Federico Cappuzzo于2009年提出的Cappuzzo标准，即平均每个细胞有5条及其以上MET基因拷贝数（MET GCN ≥5）可视为MET扩增，也有其他学者建议平均拷贝数≥6个甚至15个才能定义为MET扩增。遗憾的是这种通过拷贝数来确定扩增的方法并不能区分是多倍体还是局部扩增。另一种评估方法则很好地避免了这个弊端，通过计算MET位点数目与7号染色体（CEP7）的比值作为结果，这种比率的应用考虑了染色体的数量，能够很好地区分是局部扩增还是染色体重复，同时也控制了“核截断”的影响，只有CEP7信号的细胞将不被计算在内。第二种方法将MET/CEP7≥2.0作为MET扩增标准，这是目前最广为接受的标准。也有学者根据MET/CEP7值将扩增程度分为三组：低度扩增（1.8 - 2.2）、中度扩增（2.2 -5）和高度扩增组（≥5）。
2、二代测序（NGS）：和FISH类似，不同NGS平台对于MET扩增的定义尚无统一标准。目前大部分平台均使用读取深度（read depth）测定法，这种方法基于读长深度的信号与样本中染色体片段的拷贝数成比例的原理，并使用一些生物信息学方法进行计算，然而在敏感性和特异性上还是有一定局限。有的平台还会使用同一患者来源的良性组织或者血液样本作为对照以进一步提高敏感度，NGS的优势在于除了能够同时评估数百个基因的变异外，还具有高分辨率和从众多的复制染色体中识别局部基因扩增的能力。
临床应用的基于NGS技术的方法有两大类：扩增法和杂交捕获法，杂交捕获法能够对基因组更广泛的区域进行测序，也可以识别和剔除重复的序列，从而更准确地判断序列覆盖深度和整体拷贝数的变化。相比之下，扩增法（扩增区域仅局限于引物两侧的DNA区域）所覆盖的基因组区域有限，且可能会引入明显的序列偏倚，无法去除重复序列，从而影响对真实序列覆盖深度的判断。
目前NGS法应用广泛，但使用NGS检测扩增时必须要考虑几个技术层面的问题，首先，检测结果精确度很大程度受制于样本的纯度和质量，因为在分析过程中良恶性细胞经常混合在一起。其次因为NGS以读取深度作为评估目的基因拷贝数的关键指标，若要兼具敏感度和特异性，则必须要同时满足深度和覆盖度的要求。最后，目前尚缺乏能证实FISH法和NGS法一致性的对比研究，NGS有时会出现难以解释的结果，因为FISH目前为止被认为是相对更可靠的技术。
3、其他检测方法：NGS也能检测血浆等含有循环DNA的样本，这和NGS检测肿瘤组织的原理类似。循环DNA的获取途径通常对身体具有更小的创伤，并有可能在一定程度上避免肿瘤细胞异质性对检测精确度带来的不利影响。然而血浆为样本检测对NGS检测平台的敏感度和分辨率具有更高的要求，对DNA的丰度也有一定要求，循环DNA检测导致假阴性的可能性较组织检测会更高。此外qRT-PCR也是一种检测MET扩增的方法，但是和FISH法和NGS方法相比PCR法优势不明显，此外PCR法用于界定MET扩增的阈值也没有明确的标准。
二、临床分子病理学特征
1、原发MET扩增：
在多种实体瘤中都发现有原发MET扩增，根据肿瘤基因组计划（TCGA）和cBioPortal数据库提供的数据，MET扩增比较典型的有非小细胞肺癌（NSCLC） ，检出率约＜1-5%；胃癌中约＜1-10%；大约2-4%的结肠癌（CRCs），13%左右的I型肾乳头状癌（PRCCs）和3%左右的II型肾乳头状癌也检出MET扩增，在食管癌和肝细胞癌中检出比例较低。在NSCLC中没有发现吸烟和MET扩增之间具有相关性。在许多恶性肿瘤中MET扩增意味着预后不良。研究发现NSCLC细胞MET扩增度越高，肿瘤的MET驱动依赖性越强。MET高度扩增（MET /CEP7 ≥5，FISH法）的 NSCLC患者，很少合并其他致癌基因的驱动改变（比如EGFR突变或者ALK融合），而在MET低度扩增（MET / CEP7 ≥1.8 , ≤2.2，FISH法）和中度扩增（MET / CEP7>2.2 ，<5，FISH法）的患者中，更多合并有其他驱动基因改变（MET高，中，低度扩增合并其他驱动基因改变比例分别为0%，52%，50%）。
2、获得性（继发）MET扩增：
MET扩增可以是原发的也可以是被其他原癌驱动基因（EGFR）次级激活，这也是EGFR等TKI耐药机制之一。根据不同的检测方法和平台提供的数据，在接受一到三代EGFR TKI靶向治疗后的NSCLC患者中大约5%~20%的比例会出现MET扩增。EGFR突变的肿瘤细胞可以绕开EGFR TKI（吉非替尼或者厄洛替尼等）作用的PI3K通路，激活MET这一旁路信号通路，而PI3K通路也可以通过MET介导的HER3信号通路进一步激活。MET扩增也被发现是ALK融合阳性NSCLC癌患者对ALK抑制剂耐药的机制之一。此外，在接受抗EGFR单克隆抗体治疗的结肠癌患者和接受EGFR和BRAF抑制剂联合治疗的BRAF V600E突变的结肠癌患者中也可检测到MET扩增。当患者接受EGFR TKI治疗后MET扩增的次级激活即可发生，这种激活也可以发生在肿瘤细胞的的亚克隆群中。当使用NGS检测的样本混合有MET扩增和非MET扩增的肿瘤细胞时该结果可能会低估MET的扩增程度，为了进一步提高准确度，建议可以联合FISH或者单细胞测序进行补充。
三、靶向治疗
MET扩增水平和MET抑制剂疗效呈正相关。
1、原发性MET扩增
PROFILE 1001研究是最早开展的关于MET抑制剂疗效和MET扩增程度相关性的研究。患者分别分为低度扩增组（MET / CEP7 ≥1.8 , ≤2.2），中度扩增组（MET / CEP7>2.2 ，<5）和MET高度扩增组（MET /CEP7 ≥5），结果提示高度扩增组的客观反应率（ORR）可达67%，低扩增组和中扩增组的客观反应率ORR分别为0%和17%。随后研究组将中度扩增组界定值调整为MET /CEP7值为2.2-4.0，高扩增组界定为MET /CEP7 ≥4.0，最终结果提示总体临床获益最显著的也是高度扩增组，其ORR为40%，中位无进展生存期（PFS）为6.7个月，而低度扩增组和中度扩增组的ORR分别为33%和14%，PFS分别为1.8个月和1.9个月（图2）。
除了MET / CEP7 作为分类参照指数，也有研究揭示MET抑制剂对肺癌的疗效与MET的基因拷贝数（GCN）相关。该研究将卡马替尼用于治疗不同GCN的患者，患者的MET GCN分别为低中高三组，界定值分别为GCN <4, GCN >4 且 <6 和 GCN ≥6 ，结果提示高拷贝数组的ORR最高，可达47%，低拷贝数组合中拷贝数组的ORR分别为0%和17%。另外一种MET抑制剂沃利替尼在PRCCs中的疗效与显示出MET扩增程度相关，与之前的两个研究使用FISH 法检测MET扩增不同，本研究使用的是NGS法，MET的扩增定义为MET的 GCN≥ 6。MET扩增的PRCC患者ORR 可达43%，而GCN＜6（本研究将其定义为未无MET扩增）的患者ORR为0%。
最后来自一项名为AcSé关于克唑替尼的研究数据表明，高度MET扩增（MET / CEP7比值≥5）或中度水平（MET /CEP7比值>2.2 , <5）组的患者有着较高的药物反应率，而低MET扩增组（MET /CEP7比值≥1.8 ，≤2.2）或染色体重复/多倍体组（MET GCN >6或者MET / CEP7比值<1.8）的药物反应率较低，该研究还证实使用MET /CEP7的方法较测量GCN法能更好地评估MET扩增情况。
2、获得性耐药
对于依赖于另一驱动基因且出现MET次级激活的肿瘤患者，针对原发驱动基因和MET信号通路的联合治疗可能有效。例如EGFR突变的患者在使用EGFR TKI后耐药进展，如果是MET扩增导致的耐药，那么联合使用EGFR TKI和MET抑制剂可能是行之有效的方案。研究揭示对于EGFR突变伴随MET扩增耐药（FISH或者NGS检测结果为MET /CEP7≥2或者GCN≥5）的患者使用奥西替尼和沃利替尼联合治疗的ORR可达30%。另一项研究提示接受一/二代EGFR TKI治疗的患者出现MET扩增耐药，接受吉非替尼和特泊替尼（默克公司于2020年3月在日本批准上市，被视为革命性的MET抑制剂类药物）联合治疗，其ORR可高达67%。其他药物比如EGFR和 MET双特异性抗体JNJ-372，在EGFR耐药进展的患者中也表现出了良好的活性，这些药物在继发MET扩增的恶性肿瘤中的疗效会有更多研究揭晓。
有趣的是，联合治疗的疗效也和MET的GCN相关，一项 Ib/II期 临床研究将EGFR突变合并MET扩增的患者根据CGN分为三组（GCN <4, GCN >4 且 <6 and GCN ≥6），其中 GCN ≥6的高拷贝数组的ORR可达47%，中、低拷贝数组ORR分别为22%和12%。
总而言之，高MET扩增水平预示着使用MET抑制剂会有更好的疗效，这种预测模式对于MET抑制剂单药使用或者MET与其他TKI联合治疗都有预测意义。因此我们再次呼吁尽快实现对MET扩增的标准化定义，不仅仅是为了达到诊断意义，也是为了尽可能识别出MET改变驱动的恶性肿瘤患者并区分其扩增程度，让其从针对MET的靶向治疗获益。
MET突变
一、MET突变类型
MET的突变可发生在MET基因组内不同的位置，包括激酶结构域、14号外显子侧面的内含子剪接位点和细胞外结构域。
1、激酶结构域突变：MET突变首次于1997年在一个遗传性肾乳头状癌（PRCCs）患者体内被发现。这种胚系（生殖系）突变位点包括V1092I、H1094R/Y、M1131T、V1188L、V1220I、M1250T和D1228H/N/V。MET激酶结构域突变导致MET酪氨酸激酶活性异常增强，体外实验证实小鼠胚胎成纤维细胞（NIH 3T3细胞系）中转染MET过表达能导致细胞表型改变和恶性细胞形成，动物实验也证实能诱导恶性肿瘤的形成。非家族性PRCCs中约15%的患者可发现有体系MET突变，其中I型肾乳头状癌中多见（17%），II型肾乳头状癌中相对较少（2%）。PRCCs的体系MET突变包括了 V1092I、H1094L/R/Y、N1100Y、H1106D、M1131T、V1188L、L1195V、V1220I、D1228H/N/V、Y1230A/C/D/H、Y1235D 和M1250I/等位点，这和胚系MET突变有部分重叠。其中一些突变的活性相对较低，需要同时伴随MET扩增才能驱动恶性肿瘤的发生。MET激酶结构域的突变也可在其他肿瘤中发现，包括肝细胞癌和头颈部肿瘤，头颈部肿瘤中METY1235D突变的比例最高可达14%。
除了原发性突变，MET结构域突变也可以是继发性获得，这也是MET TKI的耐药机制之一。对于非小细胞肺癌，MET EX14、METY1230C、METY1230H、METD1228H 和 METD1228这几种突变可通过干扰激酶和药物的结合从而介导 肿瘤对克唑替尼的耐药。对于使用NSCLC患者在联合EGFR/MET TKI治疗后若再次出现耐药，MET激酶结构域突变可能是其耐药机制之一。
2、MET14 EX14 突变：正常细胞MET信号通路激活后，E3泛素连接酶CBL结合到MET EX14编码的Y1003（ CbL的酪氨酸结合位点）的近膜域残基，进而导致MET受体的泛素化和降解并形成一个自动调节的负反馈回路。当MET EX14发生突变，导致Y1003的近膜域残基异常，CBL无法与之结合启动受体的泛素化降解程序，导致MET信号通路的持续激活。这些突变中最常见的是碱基置换或者碱基插入/缺失，两种突变的比例在患者身上大约各占一半。
大多数MET EX14的突变发生的机制来源于其RNA的剪接过程受到异常干扰。在野生型状态下，MET前体mRNAs的内含子区域在转录本被翻译成蛋白质之前被剪接移除。突变如果发生在MET EX14侧就会破坏剪接过程，导致MET EX14跳跃移位。这些剪切位点的突变形式大多为范围大小不一的碱基插入/缺失，此外，导致D1010替换的错义突变，如D1010H/N/Y，也能破坏剪接过程。其他例如导致Y1003置换的突变（如Y1003F/N/S）能够干扰Cbl 的结合，与MET14 EX14 RNA剪接位点突变相似，Y1003置换突变也能导致良性细胞的表型改变，促进肿瘤细胞增殖。此外MET EX14的缺失也会导致携带Y1003的近膜结构域的丢失进而诱发类似的机制促进肿瘤发生。
MET EX14突变最开始在小细胞肺癌中被发现，但其实这种突变在NSCLC中更为常见，大约比例为3%~4%。这种突变出现在肺肉瘤样癌中的频率更高，约为9%~22%。MET EX14突变在其他诸如胃癌，神经母细胞瘤等癌种中较为少见。在许多恶性肿瘤中MET EX14突变同样可以是一种继发改变，诸如在EGFR突变的非小细胞肺癌中可能作为EGFR继发耐药的一种机制。在NSCLC患者中，MET EX14跳跃突变（跳读）的患者有吸烟史的比例较高，而出现ALK、ROS1 、RET 融合的患者中吸烟比例较小。
3、其他形式的突变：MET蛋白的信号素结构域与HGF（MET的配体）相互作用，参与形成二聚体导致受体激活。该结构域的突变包括E34K、H150Y、E168D、L269V、L299F、S323G、M362T、N375S和C385Y115,128 131（图3）。N375S是这些突变中最常见的，在NSCLC患者中约有3%~14%的比例。信号素域突变（特别是N375S）是否能激活MET目前尚有争论。有研究显示一些信号素结构域突变能降低MET的HGF结合亲和力，且在未患癌症的个体中也有发现有信息素结构域突变，但不少研究证实N375S能通过激活下游SRC和/或ERK1/2信号通路参与肿瘤形成。
二、MET突变的检测
1、DNA测序：因为MET EX14突变具有不同位点，因此，理想的NGS检测技术必须能够识别不同突变。如前所述，NGS法分为扩增法和杂交捕获法，扩增法使用引物来检测基因组区域目的基因序列，与杂交捕获法相比，这种方法可以缩短检测时间，对一些难以测序的区域有更好的捕获，但对于有重复、偏倚和等位基因丢失等区域容易出现测序失真。一些MET EX14突变比如碱基插入/缺失突变，通常位于扩增区域之外，检测可能会被遗漏。此外碱基插入/缺失突变可能会干扰引物和位点的结合，进而干扰基于引物的扩增法对其进行检测。不少研究表明相当大比例的MET EX14（50%的比例）使用扩增法NGS可能出现假阴性结果。
相比之下，杂交捕获法能很好的规避扩增法暴露的这个问题，杂交捕获法先打断DNA，用长链诱饵寡核苷酸捕获，然后再进行扩增。
序列的读取通常有几个不同的开始和终止位点，因此需要从数据中识别和剔除重复的数据，从而保证真实的测序覆盖度。这种重复测序也可以通过优化的诱饵寡核苷酸设计来尽量避免。杂交捕获法可以通过覆盖适当的内含子区域避免扩增法带来的引物结合问题，并能检测到位于内含子区域更深处的突变。杂交捕获法在识别错义突变方面也比扩增法更胜一筹。总的来说两种方法都具有较好的覆盖深度，但杂交捕获法精确度更高。
2、RNA测序：DNA测序无法确认外显子本身缺失与否，因为剪接等修饰是在翻译后水平发生。因此，基于NGS技术的RNA测序平台有望对DNA测序结果进行补充优化。考虑到MET EX14剪接位点变化的多样性，且剪接供体和受体区域比较接近，使用NGS技术进行DNA测序尤其是识别位于内含子深处的突变来说更具难度。相比之下，RNA测序可以直接识别METEX14转录的缺失。此外，由于mRNA中没有内含子，RNA测序避免了需要对众多内含子进行测序的麻烦。然而，RNA不如DNA稳定，保存时间有限，尤其是在一些非新鲜（已加工保存）的样本中。此外考虑到良性组织和肿瘤组织中mRNA表达量差异很大，以及前面所述的RNA的局限性，目前RNA测序目前仅作为传统测序方法的辅助手段，例如用于进一步确认MET EX14是否跳读。总之，若对使用DNA测序检测的数据结果存在疑虑，可以通过RNA测序作为补充。
在RNA测序技术中，锚定多重PCR（AMP测序）是目前被广泛选择可以识别MET EX14突变的技术。此法首先将来自肿瘤细胞的RNA作为模板生成互补的DNA（cDNA）（即逆转录），多重聚合酶链式反应将分子标记物嵌入其中，从而对扩增进行量化并校正扩增时的序列错误，进而在cDNA中发现MET EX14的缺失。有研究纳入232名使用杂交捕获NGS法评估为驱动基因改变阴性的患者，对其使用AMP法进行检测，结果发现了33人次驱动基因改变，包括6个MET EX14跳跃突变，这些结果都未能被NGS技术使用DNA测序识别。
除了AMP技术，使用nCounter系统的分子计数法，也被用于识别RNA层面的MET EX14缺失。该系统使用荧光标记的5’报告探针和生物素标记的3’捕获探针来检测目标转录本。与AMP测序相比，分子计数法不需要RNA逆转录的过程，也不需要扩增cDNA。而是用特殊设计带有颜色标记的探针来识别目的基因并对其进行标记，颜色强度被转化为信号值并进行量化分析，当然分子计数法尚需进一步的验证，目前缺乏和AMP的直接对比数据。
三、靶向治疗
1、激酶结构域突变的靶向治疗：针对MET的靶向治疗对于某些MET激酶结构域突变是效的。然而，不同的MET抑制剂对于不同的突变类型效果有所差异。比如II型MET抑制剂卡博替尼和foretinib，对几种激酶结构域突变表现出细胞活性（如D1228N、M1250T和H1094Y/L145），而I型MET抑制剂克唑替尼等，对上述突变无能为力。MET激酶结构域突变是MET扩增和MET EX14突变的患者对克唑替尼的耐药机制之一。这些突变能将MET激酶从激活的构象转变为非激活状态，而以克唑替尼为代表的I型MET抑制剂是和激活构象的酪氨酸激酶受体结合。
原始性MET激酶结构域突变数据很多来自于PRCC患者。有研究发现对于携带原始胚系MET突变的遗传性PRCC患者给予foretinib治疗，ORR可达50%。而对于获得性MET激酶结构域突变的数据仅仅来自于先前使用MET抑制剂出现耐药的NSCLC患者。激酶结构域突变也被认为是EGFR TKI和克唑替尼联合治疗（即使用EGFR TKI出现MET扩增耐药后双药联合治疗）出现耐药的原因之一。有个案报道，针对患者服用克唑替尼联合奥西替尼耐药可能出现了MET（D1228N）突变的情况，予以II型MET抑制剂卡博替尼联合奥西替尼患者再次出现疾病控制。
2、MET EX14突变的靶向治疗：区别于可以改变MET激酶构象的激酶结构域突变，理论上MET EX14突变型同样具有与MET野生型相似的激酶结构域。因此，I型和II型MET抑制剂都能抑制这种突变型，且在相应的肿瘤模型中显示出了良好活性。MET抑制剂最开始在MET EX14突变的NSCLC患者中表现出疗效的就是I型MET抑制剂-克唑替尼。
在“PROFILE 1001”的I期临床试验中研究人员招募了69名具有MET EX14突变的晚期NSCLC患者，进行克唑替尼疗效研究，总体中位PFS为7.3个月，在65名可评估患者中，ORR为32%。这一研究结果为克唑替尼纳入NCCN指南提供了有力证据。基于这些数据美国FDA于2018年授予克唑替尼突破性疗法资格，用于治疗接受含铂方案化疗后进展出现MET EX14突变的NSCLC患者。
自克唑替尼被FDA授予突破性疗法资格后，新的药物纷纷登场，包括括选择性Ib 型MET抑制剂卡马替尼、特泊替尼和沃利替尼，这些药物已经在MET EX14突变的NSCLC患者中进行了研究（表1）。这些选择性的MET抑制剂比克唑替尼能更有效地抑制MET活性。在一项名为“GEOMETRY”的研究中，卡马替尼单药初次治疗或者用于接受过化疗的非小细胞肺癌患者ORR分别可达68%和41%。基于此数据，卡马替尼获得了美国FDA批准用于MET EX14突变的（晚期）非小细胞肺癌患者的适应症，且并未限制药物治疗线数。
而特泊替尼（另一种选择性MET抑制剂）在一项名为 “VISION”的研究中，85例合并MET EX14突变的晚期NSCLC患者接受特泊替尼单药治疗的ORR为可达44%。在一项II期临床试验中，沃利替尼治疗MET EX14突变的肺肉瘤样癌或其他NSCLC患者ORR可达到55%。但与克唑替尼相比，这些新药的疾病控制持续时间和毒副作用尚在长期观察之中。
因为患者对MET TKIs的反应率差别很大，因此，一些研究者试图识别出患者相关的亚群特征。PROFILE 1001的研究数据表明，对克唑替尼的客观反应率和MET EX14突变的位置（剪切受体或配体位点）或突变类型（碱基插入/缺失或碱基置管）或者是否合并了MET扩增（表1）无明确相关性。这些结论也被其他选择性抑制剂诸如沃利替尼相关研究所证实。
MET抑制剂的获得性耐药机制，如MET扩增和MET激酶结构域突变，已经在耐药患者中得以确认。尽管HFG扩增在获得性耐药中已被检测出，但其扮演的角色尚需验证。虽然在一组MET扩增的人类癌细胞系和小鼠移植瘤实验中HFG降低了MET抑制剂的活性，但HFG扩增对于MET EX14突变的NSCLC患者到底有何影响尚无数据支持。
MET融合
一、临床分子病理学特征
最初在经化学致癌物转化的骨肉瘤细胞系中发现了TPR-MET（启动子区域）融合并确定了其致癌效应。随后在胃癌、甲状腺癌、肾乳头状癌、肺腺癌、肝细胞癌、神经胶质瘤和肉瘤患者中均有发现MET融合。MET融合的确切频率尚不清楚，尽管它们在神经胶质瘤中被检测出频率（约12%）较高。除了TPR-MET外，还有其他多种MET融合方式被发现（图4）。这些融合可以是染色体内融合（如PTPRZ1 MET、CLIP2 MET、CAPZA2 MET和ST7 MET）也可以是染色体间融合（如KIF5B MET），两种类型约各占一半。在胶质母细胞瘤患儿中，染色体内融合似乎更常见，最常涉见的融合为PTPRZ1。MET融合可发生在同臂（不包括着丝粒）或臂间（包括着丝粒），后者似乎更常见。
MET融合通常涉及基因组内的MET15号外显子，该外显子负责编码MET激酶结构域，以及一些MET上游基因的二聚体结构域，从而导致不依赖配体的MET受体激活。此外，一些融合（如TPR-MET）被发现未涉及14号外显子，从而使MET的激活机制类似于MET EX14跳跃突变。有趣的是，不含14号外显子的融合反而比包含14号外显子的融合（如KIF5B MET和PTPRZ MET）似乎更容易驱动肿瘤发生。在PTPRZ MET融合中，PTPRZ启动子通常和MET基因全长区域融合，包括2号外显子上的MET二聚体结构域，这种融合导致了MET的过表达和下游信号的异常激活。
二、MET融合的检测
许多技术都可以检测MET融合，包括FISH、RT-PCR和NGS。然而，这些技术都缺乏充分研究，并且对于一些复杂或新的MET融合或者MET基因重排使用FISH法难以检测。因此NGS目前是广泛应用的融合检测技术。NGS技术（DNA检测）能够较为可靠地检测多种MET融合，尽管杂交捕获法NGS还不能完全识别所有融合改变。其中原因在于在融合断点处可能出现重复的内含子DNA序列，这些序列重复也可能发生在基因组的其他区域。由于杂交捕获法会产生较短的读长，而这些数据会被作为重复序列数据被剔除，从而造成基因组融合断点无法被识别。其次，目标融合区域内含子可能非常长，这使得平铺这些序列充满挑战性且难以实施。加上DNA测序（NGS法）本身就具有局限性。如前所述，若使用基于检测RNA的AMP 或全转录组分析则可以避免这些问题。有研究对232名使用检测DNA的NGS法确定为驱动基因阴性的NSCLC患者使用基于RNA检测的AMP 技术再次进行检测，发现有12%（27人）的患者存在基因融合。这一结果提示AMP可以作为基于DNA检测的NGS法的补充手段，特别是对于驱动基因检测为阴性的患者。
三、靶向治疗
目前，MET抑制剂在MET融合阳性的肿瘤患者的应用尚待验证。实验室报告MET TKIs可诱导TPR- MET转染细胞系的凋亡，在MET融合阳性的肺腺癌和神经胶质瘤患者也有使用克唑替尼有效的个案报道。在PROFILE 1001研究中有1名特殊的患者因为存在MET融合导致MET EX14跳跃突变，这名患者对克唑替尼也表现出了客观反应。其他一些临床研究（NCT02978261, NCT03993873 ， NCT01639508）也评估了MET TKI对MET融合阳性患者的疗效。目前为止尚无大样本的关于MET融合阳性患者对于MET TKI疗效的报导。
MET过表达
MET过表达在肿瘤发生中扮演了不同的角色。首先MET可在肿瘤细胞缺氧和/或炎症环境下被诱导转录，激活增殖、减少凋亡和促进细胞迁移。因此，即使在没有MET扩增、突变或融合等基因改变驱动的情况下，肿瘤也可能依赖于MET信号而发生。理论上也可以对其使用MET抑制剂，但目前对其使用MET单抗治疗以失败告终，对MET过表达的患者使用MET TKI也几乎没有表现出疗效。令人期待的是一些双特异性抗体（作用于同一个受体的两个不同的表位）和抗体-药物偶联剂（Antibody-drug conjugates，以下简称ADCs药物）正在进行试验阶段。此外，MET过表达可以和MET基因其他改变同时存在。
一、过表达的检测
1、免疫组织化学法（IHC）：许多抗MET抗体已被用于MET过表达的免疫组化（IHC）检测。这些抗体包括单克隆抗体（如SP44、cMET和MET4）、多克隆抗体（如多克隆MET AF276）和磷酸化MET抗体（如pMET Y1349）。其中较常用的是兔抗总MET单克隆抗体SP44。这些抗体目前孰优孰劣尚无明确结论。评估MET的表达有不同的评分系统。MET的表达水平通常被量化为0到3分的染色评分，依次对应表达水平为阴性（0）、弱阳性（1+）、中阳性（2+）或强阳性（3+）。染色分数为1+表示有MET表达，评分为2+（MET过表达）即至少50%细胞的呈现染色阳性，这一分数是临床试验中MET阳性的常用界定值。另一种评分系统是H-score系统，其评估方法是将染色得分≥1分的细胞百分比乘以染色强度得出一个分值。H分值范围为0-300分，200分以上分值被认为MET过表达，但在不同的研究中设定有不同的界定值，一些研究者将中位H分数作为划分过表达的标准（包括一些特殊样本的H分数同样纳入计算）。因为缺乏统一，这就使得使用这种方法开展的研究难以标化和普及。
2、质谱分析：基于质谱的选择性反应（SRM-MS）首先对肿瘤细胞的蛋白进行连续电离和裂解，然后计算每个样本MET蛋白的分子量（每微克的摩尔量）。SRM-MS可以对福尔马林固定石蜡包埋的组织切片中MET进行定量分析，包括固定1年以上的标本。研究报告显示质谱法可重复性也很强。与免疫组化相比，SRM-MS不太容易受到观察者间偏倚的影响，可以检测到较低水平的蛋白表达。然而，SRM- MS不能区分表达的蛋白来自于肿瘤细胞还是普通细胞，因此，MET定量检测结果可能受到混合间质和/或炎症浸润细胞的影响。此外，SRM-MS比IHC技术要求更高，也更昂贵，导致其很难被广泛使用。免疫组化目前在病理学诊断中还是最常规使用的方法，而SRM-MS在很大程度上目前处于研究阶段。
二、MET过表达和其他MET基因变异的相关性
MET过表达检测已在研究作为筛选MET驱动改变的一种手段。遗憾的是，MET过表达并不是MET扩增或MET EX14突变的可靠指标，目前对于MET融合检测的数据也比较有限。不同于ALK的检测，ALK使用IHC检测到的过表达水平与FISH检测到的ALK基因重排存在密切关联，而MET融合却不具备这一相关性。
1、过表达和MET扩增的相关性： 如前所述，IHC检测的MET过表达与MET扩增无明确相关性。这种相关性的缺失可能因为样本中MET扩增水平较低，大量无蛋白表达，也有可能是受到了转录后和/或翻译后调控。在肺癌突变联盟（LCMC）的一系列研究中，74名MET过表达（H评分≥200分）患者中仅仅只有1例（1%）检测出MET扩增（MET/CEP7＞2.2），以上研究使用FISH法进行MET扩增检测，NGS法数据有限。
2、过表达和MET突变的相关性：尽管理论上大家认为NSCLC细胞中MET EX14突变总会伴随MET蛋白的过表达，但是在这些MET EX14突变的患者中不论使用IHC或者质谱检测总有部分结果为MET表达阴性。在一项纳入25例MET EX14突变NSCLC患者的研究中，只有16例（64%）呈现MET过表达（IHC 染色评分2+），使用质谱检测也发现三分之一左右患者MET表达呈现阴性。与MET扩增的肿瘤类似，MET EX14突变患者的MET表达可能也受到转录后或翻译后水平的调控因此导致基因表达和蛋白表达水平分离。在之前讨论的肺癌突变联盟系列研究中，74例MET过表达（H评分≥ 200）患者中仅仅只有2例（3%）中检测到MET EX14突变。其他研究表明，使用MET过表达结果（IHC法检测）作为MET EX14突变的预测指标敏感性和特异性并不稳定，有研究在NSCLC患者组群中发现这种预测14%的敏感性和特异性分别为14%和47%，而在肺肉瘤样肺癌中敏感度为20%，特异性为83%。对于其他MET突变（如激酶结构域突变），MET过表达作为预测指标的相关研究也尚未大规模开展。
三、靶向治疗
目前大部分研究认为MET过表达并不预示着能从MET抑制剂治疗中获益。可能原因包括很难从表达和过表达这样一个连续变量中给出一个明确的界定值，也很难从MET表达水平去量化评估MET驱动的依赖程度。尽管目前对MET过表达界定值依然缺乏统一，但是在许多肿瘤中均可检测到MET过表达，研究报道约66%的NSCLC癌患者,63%的胃癌均有MET过表达。一些抗MET的抗体（onartuzumab和 emibetuzumab）、抗HGF的抗体（ficlatuzumab 和 rilotumumab）类药物和小分子口服TKIs（克唑替尼, 卡博替尼, 替万替尼, 特泊替尼、SAR125844 ）已经展开了临床研究，这些药物单药治疗MET过表达的患者整体疗效均很低，例如一项针对MET过表达肝细胞癌患者的III期临床研究，口服替万替尼组的中位总生存期（OS）和口服安慰剂组并无明显差别（分别为8.4个月和9.1个月；P = 0.81），同样是MET过表达的肝细胞癌患者，特泊替尼治疗组也仅仅只获得了2.8个月的短暂中位无疾病进展生存期（PFS），这些研究表明MET过表达并不意味着临床获益。抗MET抗体类药物单药使用效果也不理想，许多研究尝试将抗体类药物和化疗或者EGFR TKI联合治疗，因为很多MET驱动改变继发于EGFR治疗后的耐药。然而遗憾的是，这种联合治疗的II期临床试验结果似乎充满希望（有PFS和OS的改善），但随后III期临床研究结果却显示联合治疗对于MET过表达患者无明显临床获益。
对此，有研究对新的抗MET抗体治疗策略进行了探索，包括能针对MET不同表位的抗体（如Sym015），这些抗体对MET过表达和MET EX14突变的细胞系表现出实验室活性。以MET为靶点的抗体偶联药物（ADCs）也在研究中。这些药物的优势在于他们能借助MET瞄准肿瘤细胞，无关肿瘤细胞对MET通路依赖程度，即使在较低的MET表达水平也能实现有效的药物载荷传递。例如，在一项针对ADC类药物telisotuzumab vedotin（Teliso-V）作用机制的研究中，发现MET表达水平与各种实体肿瘤治疗效果无明显相关性，但值得注意的是MET也可以在正常肺组织中表达，因此，肺毒性可能是这类治疗的潜在问题。
对于MET过表达和MET基因变异相关性的结论，有学者却持有不同观点。有研究对MET EX14子突变的NSCLC患者进行了MET过表达检测，69%的患者通过SRM-MS检测提示过表达为阳性（11/16）31%的肿瘤患者（5/16）为阴性，此外，在MET表达阳性的患者中克唑替尼也表现出较高的ORR（55%，6/11）中，阴性组的ORR却为零（0%，0/5）。这些结果似乎表明，在合适的情况和条件下，可以通过检测MET表达水平尽可能地识别出MET基因驱动依赖的恶性肿瘤并让其从针对MET的靶向治疗获益。MET过表达与MET扩增之间的关系目前尚不清楚，需要更多前瞻性的探索研究。
讨 论
随着MET基因变异的检测技术不断发展，MET抑制剂药物不断推陈出新，针对MET的靶向治疗越发引起临床医生的关注，也有更多的患者从中获益。但MET基因变异类型繁多，不同检测平台缺乏统一标准，各种肿瘤对MET驱动依赖程度有所差异，不同患者组群对于药物反应率千差万别，这些都是临床医师实施靶向治疗时必须面临的挑战。目前针对MET基因的扩增、突变、融合均能被FISH、NGS等方法所检测，MET扩增程度越高，靶向治疗获益的可能性也越大。一些针对14号外显子跳跃突变的药物已经批准上市。相比之下，MET融合的治疗意义仍未得到充分探索。目前亟需解决的问题在于对于不同的检测平台制定标准化的界定阈值，发展出更全面更先进的检测技术，才能更好地识别出MET基因驱动依赖的恶性瘤及其依赖程度水平，让这些患者从针对MET基因变异的靶向治疗获益。
*重点小结及相关扩展
1、常见MET TKI分类
2、MET基因变异类型汇总
3、不论是NGS还是FISH法检测，不论是使用GCN还是MET /CEP7界定的MET扩增，扩增水平越高，临床获益可能性越大。
4、对于MET EX14突变的患者，MET TKI客观反应率和突变的位置（剪切受体或配体位点）或突变类型（碱基插入/缺失或碱基置管）或者是否合并了MET扩增无明确相关性
5、目前主流观点认为MET蛋白过表达并非MET基因变异的平行预测指标，也不是MET TKI疗效的预测指标。
