液体活检在胃肠胰神经内分泌肿瘤中的应用现状
摘要
胃肠胰神经内分泌肿瘤（gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasms，GEP-NENs）是一类起源于神经内分泌细胞且具有神经内分泌功能的肿瘤。由于GEP-NENs的临床症状和生物学行为缺乏特异性，因此早期误诊率和漏诊率极高。同时，原发部位和分级不同的GEP-NENs分子生物学特性差异较大，因此该类肿瘤具有高度的异质性。目前对于该类疾病的诊断主要依靠于影像学和组织活检等传统方法。这导致只能获得取样位置的基因信息，而不能反映肿瘤的整体情况。近年来，随着基因组测序技术的高度发展，循环生物标志物和液体活检技术弥补了组织活检所带来的局限性，为提高GEP-NENs的诊断率和实现精准治疗带来了新机遇。本文将总结并比较液体活检在GEP-NENs中的应用现状。
概述
神经内分泌肿瘤（neuroendocrine neoplasm，NE Ns）是一种起源于弥漫性神经内分泌细胞的异质性肿瘤。胃肠胰神经内分泌肿瘤（gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasms，GEP-NENs）是一类发病率最高的神经内分泌肿瘤[1]。根据胚胎来源，可将GEP-NENs分为前肠（胃十二指肠和胰腺）、中肠（空肠、回肠、盲肠和阑尾）和后肠（远端结肠和直肠）肿瘤。目前，GEP-NENs的诊断主要依靠组织活检技术及影像学检查。但现行的组织活检技术在GEP-NENs中存在许多局限，如：无法对特殊部位进行组织活检，反复取样活检对患者创伤较大，肿瘤异质性较大，单个转移部位的活检结果无法反映肿瘤整体特点。此外，组织活检很难对患者病情进行动态监测。而影像学检测手段仍然以内镜、CT、MRI结合18F-PET/CT为主，导致大部分患者缺乏对生长抑素受体的检测并暴露于辐射中，同时影像学手段不易发现隐匿性转移灶或术后微小残留灶。因此开发新的检测技术对于GEP-NENs诊断势在必行。
液体活检是一种快速、方便、无创的检测技术，其优势在于可以通过非侵入性的方法获取患者的血液、尿液和粪便等样本进行诊断，并且能实时、精准地反应患者的整体情况。目前液体活检常用的检测样本为患者的血液，主要的检测物包括循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循环肿瘤RNA（包括NETest及microRNA）和循环肿瘤细胞（circulat ing tumor cells，CTCs）[2]。本文就GEP-NENs诊断手段中传统生物标志物的局限及液体活检技术的应用现状进行综述。
01 传统生物标志物的局限
神经内分泌细胞和GEP-NENs可向循环系统中分泌肽、胺和其他分子，这些分子可作为生物标志物用于疾病诊断和病情监测。其中非特异性循环肿瘤标志物包括嗜铬粒蛋白A（chromogranin，CgA）和神经元特异性烯醇化酶（neuron- specific enolase，NSE）等。但受某些疾病及药物影响，其敏感性和特异性均不高。CgA的灵敏度在32%~92%之间，特异性在50%以下[3]。NSE敏感性仅39%~43%，特异性仅65%~73%。因此仅能用作辅助诊断，不能单独作为诊断和评价疗效的指标。特异性循环肿瘤标志物包括5-羟基吲哚乙酸、胰岛素、胃泌素、血管活性肠肽、促肾上皮质激素、甲状旁腺激素和生长激素释放激素等。相比于非特异性循环肿瘤标志物，这些生物标志物的特异性稍高，但由于GEP-NENs的临床症状缺乏特异性，不能仅凭单一循环肿瘤标志物进行诊断，往往需要协同影像学及组织活检等手段进行诊断。因此，若能探索新的循环肿瘤标志物以辅助诊断和治疗，将为GEP-NENs患者带来极大获益。
02 ctDNA在GEP-NENs中的应用
2.1 ctDNA的概述
ctDNA在1948年首次被描述，主要由凋亡或坏死的细胞在血液中所释放的短核酸片段组成[4]。研究表明ctDNA应用广泛，如肿瘤诊断、微创分子分析、治疗监测、残留疾病检测和耐药突变识别。检测ctDNA的技术主要包括1999年起提出的指趾PCR（dP-CR）[5]、液滴指趾PCR（ddPCR）[6]以及联合流式技术及dPCR技术的乳液微滴指趾分析技术（BEAMing）[7]。2012年起随着测序技术的发展，定向测序方法如标记扩增深度测序技术、全基因组测序、全外显子组测序及下一代基因测序技术成为检测ctDNA的主要手段[8]。
2.2 ctDNA能够提高诊断的准确性
目前对于GEP-NENs中ctDNA的研究主要集中于识别ctDNA中的突变基因或转录谱，以提高诊断的准确性。Boons等[9]在1例依据世界卫生组织（WHO）2010标准被定义为G3级患者的血液和组织中均检测到了DAXX的缺失，依据WHO2017重新修订的标准，该患者经病理证实被定义为分化良好的神经内分泌瘤（neuroendocrine tumor，NET），这说明基于液体活检检测同样可以对神经内分泌癌（neuroendocrine carcinoma，NEC）和分化良好的G3 NET患者进行更好的划分。2016年欧洲神经内分泌肿瘤学会（ENETS）大会上有报道提出，利用全外显子组测序可以在胰腺神经内分泌肿瘤（pancreatic neuroendocrineneo plasm，pNENs）患者的血液中检测到ctDNA的突变，且与组织学检测到的突变一致[10]。目前针对pNENs分子研究中发现的突变基因除了DAXX外还包括MEN1和ATRX[11]。针对小肠神经内分泌肿瘤（small intestinal neuroendocrine neoplasm，siNENs）的研究中发现8%的患者发生CDKN1B突变[12]。尽管目前有关ctDNA在GEP-NENs诊断方面的研究取得了一定的成果，但大多数研究仍处于初级阶段，缺乏大数据验证及理论支持，仍需高质量研究以增加其可信度。
2.3 ctDNA能够指导治疗并实现动态监测
传统组织活检的并发症发生率较高，且往往难以获得足够的组织材料用于基因组分析（失败率为10%~30%）。反复及多部位穿刺为患者带来了身心压力及经济损失，为疾病的动态监测造成了障碍。ctDNA具有指导治疗并实现动态监测的作用，但目前的研究主要为个案报导。Wang等[13]利用ctDNA检测发现，1例转移性非典型性类癌患者中存在ALK异位，在使用ALK抑制剂阿来替尼后患者肿瘤持续缩小。Klempner等[14]在1例直肠神经内分泌癌患者的尿液中检测到了BRAF V600E突变，且该患者在使用BRAF/MEK抑制剂后，症状得到明显的改善。除了对ctDNA的研究，Boons等[9]对10例pNENs患者的肿瘤特异性无细胞DNA（cell-free DNA，cfDNA）进行检测。研究发现，在转移患者中，肿瘤组织的拷贝数变异分布与cfDNA显著相关，因此cfDNA可能与患者的预后相关。检测血液中DNA甲基化的研究仍然在探索中。
ctDNA的检测具有无创、取材方便等优势，为不能进行肿瘤活检的患者提供检测机会。同时随着检测技术的提高，其准确性也得到验证，为替代重复有创活检以实现病情动态监测提供了可能。但ctDNA的检测需要大量的肿瘤DNA释放和肿瘤相关突变的存在，这导致了NENs患者检测的局限性。因此目前针对ctDNA在GEP-NENs应用的探索仍然集中于发现新的突变基因，尚缺乏统一的定量标准，且检测成本过高以至于在一定时间内难以在临床实践中推广。因此开发新的检测技术，寻找新的突变基因，统一定量标准，降低检测成本是未来需要研究探索的方向。
03 ctRNA在GEP-NENs中的应用
3.1 NETest在GEP-NENs诊断中的意义
除了避免多次活检，在临床实践中还需考虑如何早诊断“隐匿”部位的原发肿瘤，以及生长抑素受体低表达所致的影像学不易识别的微小肝转移灶。因此除了对影像学技术的开发，NETest是目前较有前景的检测手段，其通过对2个GEP-NENs的微阵列数据集和1个包含正常肿瘤组织以及其他癌组织的微阵列数据集进行网络互作，排除正常组织基因及与其他癌种相同的基因，最终可在外周血中检测到51个针对NENs的候选基因。目前的检测方法是从全血中分离mRNA，利用PCR检测cDNA的产生[15]。51个转录本被列入NETest中[16-17]，最终结果用NE Test得分（0~100分）表示[18-19]。评分标准：≤20分诊断为正常，21~40分诊断为疾病稳定，41~100分诊断为进行性发病[20-22]。在GEP-NENs患者的诊断中，NETest的敏感性和特异性均>90%，较CgA和胰抑素显示出了良好的优越性[17]。同时也为GEP-NENs特别是siNENs这种隐匿部位的早诊带来了机遇。
3.2 NETest相较于影像学的优势
NETest具有极高的敏感性，能识别所有类型的NENs。在确诊阳性的患者中，相较于68Ga-SSA PET/ CT，NETest诊断的准确性达到98%，说明NETests可能具有生长抑素成像的辅助价值[23]。一项来自美国的真实世界研究（NCT02270567）证明NETest可以预测患者对生长抑素类似物（somatostatin analogues，SSA）治疗的疗效，准确性达到100%，可减少50%影像检查的使用[21, 23]，同时还可以对使用SSA的患者进行动态监测。此外，NETest可以检测到影像学或单个生物标记无法检测到，但经组织学证实的隐匿性肝转移疾病[24]。这弥补了影像学检查的不足，证明NETest具有早期发现转移灶和术后残留灶的优势。Laskaratos等[25]对34例接受原发部位手术的siNENs患者肠系膜纤维化（mesenteric fibrosis，MF）进行评估，结果显示NETest-纤维小体对显微镜下MF的检测准确率为100%。因此NETest对于放射学标准检测图像阴性的MF患者是一种有前途的非侵入性生物标志物。
3.3 NETest对于预后的判断
NETest也可以判断肿瘤活性从而判断疗效及预后。依据NETest可将肿瘤活性分为低、中、高三种类型，其中低活性组评分≤40分，中活性组评分41~79分，高活性组评分80~100分。真实世界研究（NCT02270567）中纳入100例患者，其中68%为GEP-NENs，该研究对患者进行了为期6~12个月的随访，结果显示肿瘤活性低的患者可能获得更好的疗效和预后[20-23]。多肽受体介导的放射性核素治疗（peptide receptor radionuclide therapy，PRRT）一般被用于治疗转移性或者不可手术的患者，研究证明NETest还可被用于评价预测对PRRT治疗的反应[24]。一项纳入35例pNENs及siNENs患者的NETest检测结果显示术前所有患者的NETest均升高，而CgA升高的仅14例。并且术后NETest有下降趋势：从（80±5）分降至（29±5）分（P < 0.0001），术后NETest数据监测显示R0切除的患者中有4例回升，且6个月后经影像学证实为复发[26]。一项研究对13例接受原发性肿瘤和/或肠系膜肿块手术切除的siNENs患者，进行术前术后的NETest和CgA的监测并与影像学检查进行对比，结果显示siNENs患者经根治性手术治疗后NETest评分明显降低，即NETest评分能准确评价siNENs患者的手术疗效，且术后监测NETest可以识别肿瘤残留并及早发现病情进展[27]。
NETest是目前最具前景的循环标志物之一，在诊断中具有早期诊断及发现隐匿病灶的优势，在治疗方面能准确预测药物疗效和实现病情动态监测，同时能对患者的预后进行判断。但是由于其成本较高导致了其临床应用的局限性，且其实际应用仍需大样本数据的评估。因此，如何提高检测技术，降低检测成本是NETest未来发展的方向。
3.4 microRNA在GEP-NENs中的应用
microRNA是一种非编码性小RNA，长度为21~ 25个核苷酸，可与mRNA的3'UTR进行特异性相互作用，从而调控转录后的基因表达。目前多项研究探索microRNA在GEP-NENs中的应用。miR-140和miR-21在pNENs中高表达，同时miR-21的表达与Ki67指数和肝转移密切相关，可以通过靶向PDCD4调节肿瘤增殖、侵袭、转移[28]。在siNENs中miR-96、miR-182、miR-183、miR196a、miR-200a等均为高表达[29]。高表达的miR-196与淋巴结转移、高有丝分裂计数、高Ki67指数、总生存期（overall survival，OS）和无病生存期（disease-free survival，DFS）降低显著相关[30]。此外，部分microRNA的表达下调也提示肿瘤可能发生转移，例如miR-133a、miR-1和miR-143- 3p与转移相关。尽管上述多项研究证实microRNA能够调节GEP-NENs的增殖转移，但是目前对于循环microRNA的检测缺乏统一标准，且患者个体差异较大，因此有待继续研究[31]。
04 CTCs在GEP-NENs中的应用
绝大部分CTCs的表面存在上皮细胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecules，EpCAM），Cell- Search平台可通过对EpCAM的富集来检测并计数CTCs。Khan等[32]在2011年首次证实了NENs中存在EpCAM的表达，并将CTCs描述为NENs的循环肿瘤标志物。CTCs虽然与肿瘤有直接关系，但因研究技术的局限性相关报道较少。有研究表明CTCs来源于原发性肿瘤和继发性疾病部位，通常与疾病进展相关。同时，研究显示在G1、G2期NENs中，CTCs的存在与肿瘤负荷增加及CgA升高有关，并且与较低的无进展生存期（progression-free survival，PFS）和OS相关[33]。此外，CTCs计数可对患者的治疗疗效进行动态监测。一项对138例NENs转移患者的研究发现，对CTCs的动态监测有助于预测患者总生存和对于治疗的反应性。相较于治疗前的基线检测，治疗后CTCs降低50%以上或者检测不到代表患者的预后更好[33]。此外，CTCs与生长抑素受体和骨转移之间的关系仍在探索。研究发现CTCs的存在与GEP-NETs骨转移相关[34]。但CTCs的敏感性较差，通过Cell- Search平台搜索显示，中肠NENs和胰腺NENs患者中CTCs检出率分别为43%和21%[35]。
综上所述，CTCs敏感性和特异性较差，因此目前研究仍仅限于患者疗效的动态监测及预后的判断，其诊断方面的研究仍需探索。目前多项研究证实在GEP-NENs中，液体活检技术可能是未来最具潜力的诊断手段，但距离临床应用尚面临一定挑战，其优势和局限见表 1。
表 1 液体活检技术的优势与局限
05
结语
GEP-NENs的传统诊断方法主要为组织病理学检查和影像学检查。新兴诊断方法如液体活检的应用弥补了组织活检和影像学反复取样及漏诊隐匿病灶等不足。液体活检除用于疾病诊断外，还可用于疾病监测及疗效判断。ctDNA、NETest、microRNA和CTCs是目前研究的热点标志物。其能从更宏观的角度评价患者的整体情况，相较于组织学和影像学更加精准、方便，为实现GEP-NENs患者的个体化诊疗提供了新的机遇。但由于检测手段的限制以及缺乏大样本数据支持，其临床实际应用仍具有局限性。对于未来液体活检的探索应该结合多学科多角度，积极寻找新的生物标志物，增强检测灵敏度，提高检测技术，降低检测成本，实现集早诊、治疗指导和动态监测为一体的诊疗技术。
End
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