血清胱抑素 B

Stefin B（也称为胱抑素B）是一种小蛋白，是半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族的成员（Jarvinen和Rinne，1982；Turk和Bode，1991）。它已从人的脾脏和肝脏中分离出来，其氨基酸序列已被完全确定。它广泛分布并且主要定位于细胞内，但已发现于细胞外。人们认为它的作用是防止蛋白酶从溶酶体泄漏。

细胞遗传学位置：21q22.3
基因座标（GRCh38）：21：43,773,949-43,776,307

▼ 克隆和表达
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在定位克隆过程中，负责进行性肌阵挛性癫痫的基因（EPM1A；254800）已定位到D21S2040和D21S1259之间约175 kb的21号染色体上，Pennacchio等人（1996）发现了一个编码胱抑素B的cDNA，该蛋白先前已知，但尚未定位到特定的染色体位点。他们证实了以前的报道，通过证明由cDNA克隆制成的探针在所有检查的组织中检测到长度约为0.8 kb的mRNA，可以广泛表达编码胱抑素B的基因。在Northern印迹上，与未受影响的非携带者个体和EPM1患者的携带者父母相比，来自4个无关家庭的患病个体的淋巴母细胞显示出降低的胱抑素B mRNA水平。

Jerala等（1988年）通过固相亚磷酸酯方法合成了编码人Stefin B的基因，并将其克隆到pUC8克隆载体中。在表达载体中制备的蛋白质对木瓜蛋白酶具有抑制作用，并与抗人Stefin B的抗体发生反应。Pennacchio 等人（1996）指出，胱抑素B是组织蛋白酶L（116880），H（116820）和B（116810）的紧密结合的可逆抑制剂。

▼ 基因结构
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Pennacchio等（1996）对来自患病家庭和未患病家庭的EPM1个体的STFB基因进行了测序。测序表明，STFB基因的长度为2500 bp，含有3个编码98个氨基酸的小外显子，其成熟的mRNA和氨基酸序列以前是已知的。

Pennacchio和Myers（1996）分离并表征了小鼠胱抑素B的同源物。该基因跨3 kb基因组DNA，在人类和大鼠中均含有3个外显子。该基因编码一种预测的98个氨基酸的多肽，其长度与大鼠，牛和人类的基因相同，并且与其他物种的基因分别具有86％，71％和79％的相似性。通过Northern分析，他们表明小鼠半胱氨酸蛋白酶抑制剂B在许多组织中都有表达。

▼ 基因功能
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Di Giaimo等人使用酵母2杂交系统（2002年）确定了5个与半胱氨酸蛋白酶抑制剂B相互作用的重组蛋白，它们都不是蛋白酶。其中的三种蛋白质RACK1（176981），β-​​血影蛋白（见182790）和NFL（162280）与半胱氨酸蛋白酶抑制剂B在大鼠小脑中共免疫沉淀。共聚焦免疫荧光分析表明，相同的蛋白质存在于发育中的小脑的颗粒细胞以及成年大鼠小脑的浦肯野细胞中。作者提出，胱抑素B多蛋白复合物可能具有特定的小脑功能，并且该功能的丧失可能有助于EPM1的发病。

Alakurtti等人在人类原代成肌细胞中使用单克隆CSTB抗体和细胞器特异性标记（2005年）表明，内源性CSTB不仅定位于细胞核和细胞质，而且还与溶酶体结合。在分化为肌管后，CSTB被排除在细胞核和溶酶体之外，这表明CSTB的亚细胞分布取决于细胞的分化状态。

▼ 测绘
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Pennacchio和Myers（1996）通过种间回交分析将小鼠半胱氨酸蛋白酶抑制剂B基因定位到小鼠10号染色体，从而扩展了小鼠10号染色体与人类21q22.3号染色体同位同源性的认识。

▼ 分子遗传学
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Lalioti等（1997）确定了来自北部非洲和欧洲的非芬兰EPM1家族中CSTB基因的6个核苷酸变化。其中之一，即外显子1核苷酸426处的纯合G到C转化，导致了gly4到arg取代（601145.0004），并且是与EPM1相关的第一个错义突变。分子模型预测该取代将严重影响胱抑素B与木瓜蛋白酶的接触。在所分析的29位无关EPM1患者中，有7位发现了6个突变，其中1位为纯合，其他位为杂合。他们还发现了5个主要非翻译区中十二聚体（CCCCGCCCCGCG）的串联重复序列为多态性（601145.0003）。他们鉴定了2个具有2或3个串联拷贝的等位基因变体。在正常的白种人人群中，3拷贝等位基因的频率为66％。

Lafreniere等（1997年）提出了20个不相关的EPM1患者和不同种族家庭的单倍型和突变分析。他们确定了4种不同的突变，其中最常见的突变包括对PCR扩增有抵抗力的大约600至900 bp的不稳定插入。该插入定位到位于启动子区域中STFB基因的5'侧翼区域中的12 bp多态串联重复序列（601145.0003）。插入的大小在具有相同单倍型和相同起源的不同EPM1染色体之间变化，这表明在许多世代的过程中，减数分裂不稳定存在一定水平。Lafreniere等（1997）据推测，这种动态突变似乎不同于常规的三核苷酸重复序列扩展，可能是通过与串联重复序列的不稳定性有关的新机制产生的。孤立地，Virtaneva等（1997年）确定了胱抑素B基因的启动子区域中不稳定的小卫星扩增（由它们标记为CST6）。他们表示，该突变占全世界EFM1患者的大多数。单倍型数据与单个祖先创建者突变兼容。重复序列的长度在染色体和家族之间有所不同，但是重复数的变化似乎是相对罕见的事件。Virtaneva等（1997）注意到不稳定的三核苷酸微卫星重复扩增与至少10种遗传性神经系统疾病有关，并且在所有情况下均与Freedreich共济失调（229300）有关，并具有强烈​​的预期。与不稳定的三核苷酸重复序列（显示出高度的代际不稳定性）不同，与EPM1相关的小卫星突变似乎不那么不稳定，并且在EPM1中尚未认识到预期。

Antonarakis（1997）证实，在纯合子状态下，胱抑素B基因中唯一与EPM1相关的点突变是甘氨酸至arg氨基酸取代（601145.0004）。在EPM1患者中鉴定出的所有其他点突变均被发现为具有12 bp重复扩增等位基因的复合杂合子。在某些患者中，重复扩增等位基因也是纯合的。Antonarakis（1997）没有发现纯合子状态下具有空位突变（例如，无意义，移码或剪接位点）的患者。所有EPM1患者均具有残留的基因活性。他提出无效等位基因的纯合性要么不可行，要么呈现不同的表型。

在详细介绍他们以前的工作时，Lalioti等人（1997）指出EPM1中常见的突变机制是十二肽重复序列的扩展（601145.0003），并认为该突变是254800中描述的芬兰疾病最可能的来源。对58个EPM1等位基因的检查表明，其中50个包含十二聚体重复扩增。除了扩大的重复突变和被认为是正常的等位基因中发现的2或3个重复，Lalioti等（1997）鉴定了具有12至17个重复的等位基因，这些重复被他们称为“突变前”，并不稳定地传递给后代。这些“突变前”等位基因与EPM1的临床表型无关。Lalioti等（1997）指出，没有发现重复扩张的次数和发病年龄或严重程度之间的相关性。

大多数EPM1等位基因包含位于CSTB基因5-引物转录起始位点上游的十二聚体重复序列的大扩展；正常等位基因包含此重复序列的2或3个副本。所有扩展的EPM1等位基因均对标准PCR扩增具有抗性。为了确定受影响个体中重复序列的大小，Lalioti等人（1998）开发了一种检测方案，涉及PCR扩增和随后与包含重复序列的寡核苷酸杂交。在EPM1患者中，检测到的最大扩增为大约75个拷贝。最小的是大约30份。他们确定了受影响的同胞在同一单倍型上具有不同大小的重复扩增，这证实了重复在遗传过程中的不稳定性。直接观察到膨胀。通过比较一个家庭中等位基因的大小推导收缩。在28位患者的样本中，他们发现EPM1发作的年龄与扩大的十二聚体的大小之间没有相关性。这表明一旦十二聚体重复超过关键阈值，CSTB在某些细胞中的表达就会降低，并带来病理后果。

先前研究中的单倍型分析表明，在4个家族中存在4个孤立的EPM1突变中的3个。通过序列比较，Pennacchio等（1996年）确定了胱抑素B基因的2个不同的突变。一个是内含子1的最后一个核苷酸（601145.0001）的G到C 转换，改变了几乎所有内含子中该位置的3-prime剪接位点AG二核苷酸的序列。在四个家族中的两个家族的胱抑素B基因的等位基因中发现的第二个突变将CGA更改为TGA，从而在第68位氨基酸处产生了翻译终止密码子（601145.0002）。尽管在4个家族中有3个的受影响的染色体中发现了这2个突变，Pennacchio等人（2002）（1996）尚无法从他们已有的剩下的1或2个等位基因中检测到编码半胱氨酸蛋白酶抑制剂B的基因中的任何序列差异。具体而言，未发现芬兰祖先突变。但是，研究表明芬兰基因以及所有其他突变等位基因的表达均存在缺陷。Pennacchio等（1996）指出，尽管该蛋白无处不在表达，但尚不清楚为什么编码半胱氨酸蛋白酶抑制剂B的基因突变会引起EPM1的症状，这是一种明显的组织特异性表型。

Alakurtti等（2005）短暂地表达4个突变改变BHK-21细胞的CSTB多肽。2400_2402delTC（601145.0005）截短的突变蛋白表现出弥散的胞质和核分布，而R68X（601145.0002）则迅速降解。两个错义突变，G4R（601145.0004），影响对组织蛋白酶结合至关重要的高度保守的甘氨酸，和Q71P（601145.0006），未能与溶酶体结合。Alakurtti等（2005年）得出结论，CSTB具有重要的溶酶体相关的生理功能，并表明这种结合的丧失促进了EPM1的分子发病机理。

▼ 动物模型
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Pennacchio等（1998）发现由于定向破坏基因而缺乏胱抑素B的小鼠会出现肌阵挛性抽搐和共济失调，类似于EPM1中所示的症状。主要的细胞病理学表现为小脑颗粒细胞的丢失，小脑颗粒细胞经常显示核浓缩，DNA片段化和其他细胞凋亡特征。EPM1的这种小鼠模型被认为提供了证据，即半胱氨酸蛋白酶抑制剂B作为一种非半胱氨酸半胱氨酸蛋白酶抑制剂，在预防小脑细胞凋亡中具有作用。

Lieuallen等（2001）从Cstb缺陷型敲除小鼠的神经组织中鉴定出7种转录水平持续升高的基因：组织蛋白酶S（116845），补体的C1q B链（120570），β-​​2-微球蛋白（109700），神经胶质纤维酸性蛋白（137780），载脂蛋白D（107740），纤连蛋白-1（135600）和金属硫蛋白II（156360）。预计这些蛋白质与增加的蛋白水解，细胞凋亡和神经胶质激活有关。Cstb缺陷型小鼠中的分子变化与小鼠模型中发现的病理学一致。

▼ 等位基因变异体（6个示例）：
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.0001乌隆堡和伦德堡的肌阵挛性癫痫
CSTB，IVS1，GC，-1
Pennacchio等人通过对Unverricht和Lundborg的肌阵挛性癫痫的4个家庭的受影响成员中的cystatin B基因进行完整测序（EPM1A；254800）（1996年）确定了胱抑素B基因的2个不同的突变。在美国家庭中发现的其中一个是内含子1的最后一个核苷酸从G到C的转化，将3个引物的剪接位点AG变成了AC。

.0002乌龙里奇和伦德堡的肌阵挛癫痫
CSTB，ARG68TER
Pennacchio等人在进行性肌阵挛性癫痫研究的4个家庭中有2个（EPM1A; 254800）（1996）发现受影响的个体在胱抑素B基因中携带了CGA-（arg）-TGA（终止）突变。

Alakurtti等（2005）在BHK-21细胞中瞬时表达R68X突变。改变的CSTB多肽被迅速降解。

.0003乌龙里德和伦德堡的肌阵挛性癫痫
CSTB（CCCCGCCCCGCG）n重复扩展，12人重复扩展，启动子区域
Lalioti等人在来自北非和欧洲的非芬兰EPM1A（254800）家庭中（1997年）确定了胱抑素B基因的5个主要非翻译区域的十二聚体（CCCCGCCCCGCG）的串联重复。他们鉴定了2个具有2或3个串联拷贝的等位基因变体。在正常的白种人人群中，3拷贝等位基因的频率为66％。

对于EPM1A，Lafreniere 等人（1997）确定纯合性的不稳定插入大约600到900 bp，对PCR扩增有抵抗力。此插入对应到位于STFB基因的5个主要侧翼区域的12 bp多态串联重复序列。在38个不相关的EPM1染色体上鉴定出了插入突变，这些染色体来自不同种族。插入的大小在具有相同单倍型和相同起源的不同EPM1染色体之间变化，表明减数分裂不稳定的水平。5-prime侧翼区域突变的最显着属性是其不稳定的性质（大小变异）及其对PCR扩增的抵抗力。这两个属性都已在脆性X综合征（300624），其代表FMR1基因的5个主要非翻译区中最多扩增4 kb的多态CGG三核苷酸重复序列（309550）。

孤立地，Virtaneva等（1997年）报道了EPM1患者的胱抑素B启动子区域内15到18聚体微卫星重复扩增不稳定。重复单元的侧翼是12聚体串联重复序列，并且顺序上类似于12聚体。单倍型数据与单个祖先创建者突变兼容。重复序列的长度在染色体和家族之间有所不同，但是重复数的变化似乎是相对罕见的事件。他们指出，该突变占全世界EPM1病例的大部分。Lalioti等（1997年）提供了进一步的证据，表明EPM1中常见的突变机制是十二聚体重复序列的扩增，而不是15或18聚体小卫星的重新扩增，Virtaneva等（1997）。

Mazarib等（2001年）研究了缺乏光敏性的5代阿拉伯EPM1家族，即肌阵挛性抽动不会因光刺激而沉淀。三个活着的受影响个体是纯合子，可以重复扩增，而16个未受影响的家庭成员中有11个是杂合子。在这个近交家族中，在同一单倍型背景上出现不同大小的扩增，证明存在不稳定性。这个家庭缺乏光敏性是无法解释的。

.0004乌龙里德和伦德堡的肌阵挛性癫痫
CSTB，GLY4ARG
Lalioti等（1997年）确定了来自非洲北部和欧洲的非芬兰EPM1（254800）家族的胱抑素B基因第1外显子上第 426位核苷酸的纯合G到C 转化。该突变导致gly4-to-arg取代，并且是与EPM1相关的第一个错义突变。分子模型预测该取代将严重影响胱抑素B与木瓜蛋白酶的接触。

Alakurtti等（2005）在BHK-21细胞中瞬时表达G4R突变。突变蛋白未能与溶酶体结合。

.0005乌龙里德和伦德堡的肌阵挛性癫痫
CSTB，2-BP DEL，2404TC
Bespalova等（1997年）描述了进行性肌阵挛性癫痫（254800）患者的CSTB编码区和剪接点的完整序列，该患者的半胱氨酸蛋白酶抑制剂B mRNA水平降低，但缺乏先前表征的突变。发现该患者在CSTB基因的第三个外显子中2 bp缺失（2404delTC）是杂合的。该突变在74个氨基酸后引起翻译移码和蛋白截短。Pranzatelli等人详细描述了患者（EP6）（1995）。Lalioti等人也发现了这种突变（1997）和Lafreniere等（1997）。Alakurtti等（2005年）在BHK-21细胞中瞬时表达2400delTC突变。截短的突变蛋白显示出弥散的细胞质和核分布。

.0006乌龙里德和伦德伯格的肌阵挛性癫痫
CSTB，GLN71PRO
de Haan等在荷兰的进行性肌阵挛性癫痫患者中（254800）（2004年）在CSTB基因中鉴定出2398A-C颠换，导致gln71-pro取代（Q71P）。

Alakurtti等（2005）在BHK-21细胞中瞬时表达Q71P突变。突变蛋白未能与溶酶体结合。