免疫细胞化学p16/Ki-67双染检测对宫颈细胞学阴性且HR-HPV阳性病例的分流作用及组织学LSIL的转归预测价值

［摘要］ 背景与目的：目前，临床上仍缺乏对宫颈细胞学阴性且高危型人乳头状瘤病毒（high-risk human papilloma virus，HR-HPV）阳性病例的有效分流措施，同时预测组织学为低度鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）的病例是否会进展为宫颈高度病变的生物学指标尚不明确。探讨免疫细胞化学p16/Ki-67双染检测对宫颈细胞学阴性且HR-HPV阳性病例的分流作用及LSIL的转归预测价值。方法：收集2017年4月—2018年7月于汕头市中心医院和中山大学肿瘤防治中心就诊、宫颈癌筛查细胞学阴性且HR-HPV阳性、30岁以上的708例已婚女性患者为研究对象。患者均进行了初次阴道镜检查和p16/Ki-67双染检测，观察p16/Ki-67双染检测结果与初次阴道镜组织学结果之间的关系，探讨p16/Ki-67双染诊断宫颈上皮内瘤变2/3级（cervical intraepithelial neoplasia 2/3，CIN2/CIN3）的效能，比较p16/Ki-67双染检测阳性率在不同亚型HPV感染组之间的差异。并对初次阴道镜组织学LSIL的223例患者随访1年，分析p16/Ki-67双染检测结果对LSIL转归的预测价值。结果：在生物显微镜下，宫颈细胞p16/Ki-67双染检测结果分为阴性和阳性两类。p16/Ki-67双染阳性患者中CIN2+的发生率［33.33%（55/165）］与p16/Ki-67双染阴性患者中CIN2+的发生率［1.10%（6/543）］相比差异有统计学意义（χ2=166.94，P<0.001）。p16/Ki-67双染阳性患者中CIN3+的发生率［26.06%（43/165）］与p16/Ki-67双染阴性患者中CIN3+的发生率［0.37%（2/543）］相比差异有统计学意义（χ2=140.35，P<0.001）。HPV其他12亚型组、HPV16/18亚型组、同时阳性组对应的p16/Ki-67双染阳性率变化经χ2趋势检验分析得知有递增趋势（χ2=29.119，P<0.001）。三组间两两比较，p16/Ki-67双染阳性率之间差异有统计学意义（P<0.01）。8例LSIL病变进展的患者中，有6例p16/Ki-67双染阳性，2例p16/Ki-67双染阴性，p16/Ki-67双染阳性诊断LSIL病变进展率是p16/Ki-67双染阴性的3倍。22例LSIL病变持续的患者中，有12例p16/Ki-67双染阳性，10例p16/Ki-67双染阴性，p16/Ki-67双染阳性诊断LSIL病变持续率是p16/Ki-67双染阴性的1.2倍。29例LSIL病变消退的患者中，有3例p16/Ki-67双染阳性，26例p16/Ki-67双染阴性，p16/Ki-67双染阳性诊断LSIL病变消退率是p16/Ki-67双染阴性的3/26。结论：p16/Ki-67双染检测对诊断CIN2/CIN3具有较高的效能，其阳性率与高危型HPV感染亚型有关，是分流宫颈细胞学阴性且HR-HPV阳性患者的有效方法，对组织LSIL的转归也具有较高的预测价值，有望临床推广使用。
［关键词］ 免疫细胞化学；p16/Ki-67；双染；宫颈细胞；高危型人乳头状瘤病毒；组织；宫颈上皮内瘤变

［Abstract］ Background and purpose: At present, there is a lack of effective shunt measures for the patients with negative cervical cytology and positive high-risk human papilloma virus（HR-HPV）. At the same time, it is not clear whether the patients with low-grade squamous intraepithelial lesion（LSIL） will progress to high-grade cervical lesions. The purpose of this study was to explore the role of immunocytochemical p16/Ki-67 double staining in the shunt of cervical cytology negative and HR-HPV positive patients and the predictive value of LSIL outcome. Methods: From Apr. 2017 to Jul. 2018, 708 married women over the age of 30 were selected from Shantou Central Hospital and Sun Yat-sen University Cancer Center. Cervical cancer screening was negative, and HR-HPV was positive in those women. All patients underwent primary colposcopy and p16/Ki-67 double staining. The relationship between the results of p16/Ki-67 double staining and the histological results of primary colposcopy was observed. The efficacy of p16/Ki-67 double staining in the diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia grade 2/3（CIN2/CIN3） was discussed. The difference in the positive rate of p16/Ki-67 double staining between different HPV subtype infection groups was compared. Two hundred and twenty-three patients with LSIL were followed up for one year. The predictive value of p16/Ki-67 double staining test results for the outcome of LSIL was analyzed. Results: Under biomicroscopy, the results of double staining of p16/Ki-67 in cervical cells were divided into two categories: negative and positive. The incidence of CIN2+ was 33.33%（55/165） in the patients with positive double staining of p16/Ki-67 and 1.10%（6/543） in the patients with negative double staining of p16/Ki-67（χ2=166.94，P<0.001）.The incidence of CIN3+ was 26.06%（43/165） in patients with positive double staining of p16/Ki-67 and 0.37%（2/543） in patients with negative double staining of p16/Ki-67（χ2=140.35，P<0.001）. χ2 trend test showed the positive rate of p16/Ki-67 in the other 12 subtypes of HPV, 16/18 subtypes of HPV and the simultaneous positive group was increased（χ2=29.119, P<0.001）. The positive rates of p16/Ki-67 double staining were significantly different among the three groups（P<0.01）. Among 8 cases of LSIL with progressive disease, 6 cases were positive for p16/Ki-67, and 2 cases were negative for p16/Ki-67. The positive rate of p16/Ki-67 double staining was 3 times higher than the negative rate of p16/Ki-67 double staining. Among 22 cases of LSIL with persistent disease, 12 cases were positive for p16/Ki-67, and 10 cases were negative for p16/Ki-67. The persistence rate of p16/Ki-67 double staining positive diagnosis of LSIL was 1.2 times that of p16/Ki-67 double staining negative diagnosis. Among 29 patients with regression of LSIL, 3 were positive for p16/Ki-67, and 26 were negative for 16/Ki-67. The regression rate of p16/Ki-67 double staining positive diagnosis of LSIL was 0.12 times that of p16/Ki-67 double staining negative diagnosis. Conclusion: p16/Ki-67 double staining test has high efficiency in the diagnosis of CIN2/CIN3. The positive rate of p16/Ki-67 double staining test is related to high-risk HPV infection subtypes. p16/Ki-67 double staining test is an effective method for cases with negative cervical cytology and positive HR-HPV. It has high predictive value for the prognosis of tissue LSIL and potential for clinical application.
［Key words］ Immunocytochemistry; p16/Ki-67; Double staining; Cervical cell; High-risk human papilloma virus; Tissue; Cervical intraepithelial neoplasia

宫颈癌是危害女性健康的第四大恶性肿瘤，全球每年宫颈癌的新发病例数大约为53万例，中国的死亡病例数约为2.6万例［1-2］。宫颈癌是目前唯一病因明确为人乳头状瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染，可通过开展合适的筛查，及早发现并有效降低发生率的癌症［3］。对于30岁以上的已婚女性目前常用的联合筛查策略是细胞学+高危型HPV（high-risk HPV，HR-HPV）检测［4］。细胞学阴性、HR-HPV阳性是常见的联合筛查异常结果，对于这种结果目前妇产科的处理流程是转诊阴道镜。Sun等［5］和Liu等［6］研究发现，平均随访2年，2.4%细胞学阴性、HR-HPV阳性患者为宫颈上皮内瘤变2级（cervical intraepithelial neoplasia 2，CIN2）。Yang等［7］研究报道宫颈细胞学阴性且HR-HPV阳性3年CIN3+累积风险约为6.8%。显而易见，过高的阴道镜转诊率造成了大量的医疗资源浪费。目前对于组织学为低度鳞状上皮内病变（low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）的临床处理共识是无需临床手术或药物治疗，仅需追踪随访［8］。Segura等［9］针对一项大样本量的初次阴道镜组织学LSIL患者随访1年，有65%的患者自然消退，20%的患者病变持续，但仍然有15%的患者病变进展。因此，寻找一种客观的分子指标来指导细胞学阴性、HR-HPV阳性患者进行分流管理，明确组织学LSIL患者宫颈病变风险，是临床迫切需要解决的问题。本研究拟为寻找一种对宫颈细胞学阴性且HR-HPV阳性患者具有分流作用及组织学LSIL患者转归具有预测价值的生物学指标提供实验依据。
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资料和方法
1.1 标本来源
收集2017年4月—2018年7月于汕头市中心医院和中山大学肿瘤防治中心经宫颈筛查细胞学阴性且HR-HPV阳性的708例已婚女性患者为研究对象，患者均进行了初次阴道镜检查并在宫颈脱落细胞标本中完成了p16/Ki-67双染检测，患者年龄30.6~78.5，平均年龄（41.3±9.6）岁。对初次阴道镜病理学检查结果为LSIL的患者随访1年，每6个月使用细胞学+HR-HPV筛查1次，除细胞学和HR-HPV阴性检测结果外，其他再行阴道镜活检术，取活体组织进行病理学检查的病例59例。研究对象的纳入标准：① 非妊娠期；② 非生理期；③ 无宫颈疾病治疗史；④ 无免疫系统疾病；⑤ 签署知情同意书。
1.2 试剂与仪器
免疫细胞化学法p16/Ki-67双染检测试剂框（包含双染试剂框专用抗原修复液、内源性过氧化物酶阻断剂、即用型组合一抗、即用型酶标第二抗体、显色剂、苏木精染色液。备案号：闽榕械备20180037号）购自福州迈新生物技术开发有限公司。HB-300C HPV化学发光免疫分析仪购自嘉兴科瑞迪医疗器械有限公司。HPV核酸检测试剂框购自杭州德同生物技术有限公司。ThinPrep2000细胞学制片仪购自北京豪洛捷医疗科技有限公司。
1.3 宫颈细胞学标本制备
在ThinPrep2000细胞学制片仪中，按仪器说明书操作规程制作细胞学薄片，将细胞学薄片固定于95%乙醇中30 min、巴氏染色，由2名资深病理科医师进行诊断，诊断术语参考最新的细胞学TBS分类系统［10］。文中细胞学阴性指细胞学结果<非典型鳞状上皮细胞（atypical squamous cells of undetermined significance，ASCUS）。
1.4 宫颈组织学标本制作
宫颈组织放入4%甲醛溶液中固定，经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、裱片、苏木精-伊红染色等步骤完成石蜡切片制作。由2名资深病理科医师进行确诊，依据为《世界卫生组织（World Health Organization，WHO）女性生殖器官肿瘤学分类（第4版）解读》［11］。文中LSIL指CIN1。

1.5 p16/Ki-67双染检测流程及判读标准

1.5.1 p16/Ki-67双染检测流程
细胞固定（宫颈细胞薄片置于95%乙醇中，浸泡30 min）、抗原修复（抗原修复液隔水加热至95 ℃，修复20 min，自然冷却，磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）冲洗3 min×2次）、阻断内源性过氧化物酶（加100 μL H2O2，室温下温育10 min，PBS冲洗3 min×3次）、加即用型组合一抗（加100 μL一抗，室温下温育60 min，PBS冲洗3 min×3次）、加即用型酶标第二抗体（加100 μL二抗，室温下温育15 min，PBS冲洗3 min×3次）、加显色液A（加100 μL显色剂A，显色10~15 min，PBS冲洗3 min×3次）、加显色液B（加100 μL显色剂B，显色5 min，流水冲洗终止显色）、复染（加100 μL苏木精染色液20 s，流水冲洗，PBS冲洗返蓝，流水冲洗）、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。
1.5.2 p16/Ki-67判读标准
阳性结果指细胞薄片中同一个细胞内细胞质呈红色着色（p16染色阳性）且细胞核呈棕黄色着色（Ki-67染色阳性），阴性结果指细胞薄片中仅为细胞核有苏木精衬染的浅蓝色，或细胞质呈红色着色（p16染色阳性），亦或细胞核呈棕黄色着色（Ki-67染色阳性）［12-13］。
1.6 HPV检测及判读标准

HPV DNA检测采用的是杂交捕获-化学发光法，检测原理为：样本中的HPV病毒双链DNA变性解开成单链，单链DNA与特异性RNA探针结合为DNA-RNA杂合体，DNA-RNA杂合体与捕获微孔板上的特异性抗体结合固定在捕获微孔板上，再与偶联有碱性磷酸酶的抗DNA-RNA杂合体的特异性抗体结合，酶促化学发光，检测样本中的HPV DNA含量。参照试剂说明书，检测过程为变性、杂交、捕获、检测、洗板、化学发光等步骤。该试剂框用于体外定性检测子宫颈脱落细胞样本中的2种（HPV16、18型）和12种（HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68型）HPV的核酸。所有的检测均以样本测量值/参考值的比值表示，比值≥1.0，结果为“阳性”；比值<1.0，结果为“阴性”。
1.7 HPV感染亚型的分组

根据HPV感染亚型的不同，分为3组。第1组，HPV其他12亚型组（限于HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68亚型中有一个亚型以上为阳性结果即纳入本组中），患者年龄30.9~72.3，平均年龄（42.6±8.7）岁。第2组，HPV16/18亚型组（限于HPV16或18亚型中有一个亚型以上为阳性结果即纳入本组中），患者年龄30.6~76.9，平均年龄（40.5±10.1）岁。第3组，同时阳性组（HPV16/18亚型组+HPV其他12亚型组同时阳性才纳入本组中）。患者年龄32.3~78.5，平均年龄（41.8±9.3）岁。3组间年龄差异无统计学意义（P>0.05）。
1.8 宫颈组织学LSIL病变的转归分类

初次阴道镜组织学检查结果为LSIL的转归包括3种情况。第1种情况，再次组织学检查结果低于LSIL的患者为消退。第2种情况，再次组织学检查结果维持LSIL的患者为持续。第3种情况，再次组织学检查结果高于LSIL，包括CIN2、CIN3和宫颈癌的患者为进展。
1.9 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件包进行数据处理。计数资料：率的比较、灵敏度和特异度的比较采用χ2检验。计量资料的比较采用方差分析。灵敏度是指由组织学诊断为阳性的病例中，经p16/Ki-67双染检测为阳性例数的比例。特异度是指由组织学诊断为阴性的病例中，经p16/Ki-67双染检测为阴性例数的比例。符合率是指p16/Ki-67双染检测中真阳性和真阴性之和占总受检人数的比例。P<0.05为差异有统计学意义。

2
结　　果
2.1 p16/Ki-67双染的图像
生物显微镜下的细胞学薄片中，宫颈鳞状上皮细胞p16/Ki-67双染的图像分为两类。一类为p16/Ki-67双染阴性，包括：① p16/Ki-67染色均为阴性（仅为细胞核有苏木精衬染的浅蓝色）；② p16单染色阳性（细胞质呈红色着色）；③ Ki-67单染色阳性（细胞核呈棕黄色着色）。另一类为p16/Ki-67双染阳性（同一个细胞内细胞质呈红色着色且细胞核呈棕黄色着色，图1）。

图 1 p16/Ki-67双染的图像
Fig. 1 p16/Ki-67 double dye image
A: p16/Ki-67 double staining, p16 single staining or Ki-67 single staining cells were not detected in cervical epithelial cell slices; B: Only the cells with red cytoplasm（p16 positive） were found in the thin section of cervical epithelial cells; C: Only cells with brownish yellow nuclei（Ki-67 positive） were seen in the cervical epithelial cell slices; D: The cytoplasm of the same cell was stained red（p16 positive） and the nucleus was stained brownish yellow （Ki-67 positive）
2.2 p16/Ki-67双染阳性与初次阴道镜组织病理学检查结果的关系
708例就诊患者中有165例患者p16/Ki-67双染阳性，双染阳性率为23.31%（165/708）。543例患者p16/Ki-67双染阴性，双染阴性率为76.69%（543/708）。在初次进行阴道镜组织病理学检查的223例患者中，p16/Ki-67双染阳性患者有12例患者为CIN2，41例患者为CIN3，2例患者为宫颈癌。p16/Ki-67双染阴性患者有4例患者为CIN2，2例患者为CIN3。p16/Ki-67双染阳性患者中CIN2+的发生率［33.33%（55/165）］与p16/Ki-67双染阴性患者中CIN2+的发生率［1.10%（6/543）］相比差异有统计学意义（χ2=166.94，P<0.001）。p16/Ki-67双染阳性患者中CIN3+的发生率［26.06%（43/165）］与p16/Ki-67双染阴性患者中CIN3+的发生率［0.37%（2/543）］相比差异有统计学意义（χ2=140.35，P<0.001）。
2.3 p16/Ki-67双染检测诊断HR-HPV阳性而液基薄层细胞学检查（thinprep cytology test，TCT）阴性患者的CIN2/CIN3效能
针对本研究中HR-HPV阳性而TCT阴性的患者，以初次组织病理学检查结果为金标准，p16/Ki-67双染诊断该群体患者的CIN2/CIN3整体效能较高。p16/Ki-67双染对该群体患者的CIN2+和CIN3+病变诊断的灵敏度、特异度和符合率之间差异均无统计学意义（P均>0.05，表1）。

2.4 p16/Ki-67双染阳性率在不同HPV亚型感染组之间的差异
708例就诊患者中，HPV其他12亚型组、HPV16/18亚型组、同时阳性组所占的比例分别为71.89%（509/708）、20.76%（147/708）、7.34%（52/708）。3组对应的p16/Ki-67双染阳性率分别为18.66%（95/509）、29.25%（43/147）、51.92%（27/52）。上述3组的阳性率经χ2趋势检验分析，有递增趋势（趋势χ2=29.119，P<0.001）。且3组间p16/Ki-67双染阳性率总体差异有统计学意义（χ2=32.869，P<0.001）。进一步进行两两比较，同时阳性组的p16/Ki-67双染阳性率分别与HPV其他12亚型组（χ2=30.668，P<0.001）、HPV16/18亚型组（χ2=8.658，P=0.003）相比差异均有统计学意义。HPV16/18亚型组的p16/Ki-67双染阳性率与HPV其他12亚型组相比差异有统计学意义（χ2=7.697，P=0.006）。
2.5 不同p16/Ki-67双染表达对组织学LSIL患者转归的预测价值
对初次阴道镜活检术组织病理学检查结果为LSIL的患者进行随访1年，每6个月使用细胞学+HR-HPV进行筛查1次，除细胞学和HPV阴性检测结果外，其他均再次行阴道镜活检术，必要时再次取活检病理学检查的病例59例。8例LSIL病变进展的患者中，有6例p16/Ki-67双染阳性，2例p16/Ki-67双染阴性，p16/Ki-67双染阳性诊断LSIL病变进展率是p16/Ki-67双染阴性的3倍。22例LSIL病变持续的患者中，有12例p16/Ki-67双染阳性，10例p16/Ki-67双染阴性，p16/Ki-67双染阳性诊断LSIL病变持续率是p16/Ki-67双染阴性的1.2倍。29例LSIL病变消退的患者中，有3例p16/Ki-67双染阳性，26例p16/Ki-67双染阴性。
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讨　　论
中国35~64岁的适龄女性需要接受宫颈癌筛查人数约3亿［14］。2009—2017年累计筛查人数约为7 000万，占实际需要筛查人数的23.33%［15］。面对数量庞大的筛查人群，准确、简便、高效的筛查手段显得尤为重要。当前，细胞学联合HR-HPV检测是筛查宫颈癌的共识。但是，细胞学筛查面临的问题在于主观性强，依赖病理科医师的经验，灵敏度较低，容易出现漏诊。HPV检测无法区分一过性感染和转化型HPV感染。细胞学阴性、HR-HPV阳性的筛查结果是临床常见的异常类型。从逻辑上说，只有HPV感染持续才会有细胞学阳性，HPV感染首先发生细胞学的变化，但是过高的HPV一过性阳性反而增加了患者的心理压力，且细胞学取材具有局限性，还与操作者和阅片者水平差异相关，漏诊的情况时有发生。目前临床上对于细胞学阴性、HR-HPV阳性患者的处理，大量阴道镜转诊容易造成过度医疗，而对于组织学LSIL尚缺乏早期风险预测指标。因此，寻找一种客观的能用于对细胞学阴性、HR-HPV阳性患者的分流管理，明确组织学LSIL宫颈病变风险的生物学指标具有重要的临床价值。
p16蛋白是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂［16］。p16过表达提示宫颈细胞处于细胞周期的阻滞期。Ki-67标记指数反映细胞周期进展及增殖活跃［17］。Ki-67染色阳性提示宫颈细胞处于细胞周期的增殖期。p16和Ki-67同时阳性，则提示细胞周期调控失调。正常生理状态下，p16和Ki-67的表达相互制约，达到一种动态平衡的状态，且不会同时出现于同一个细胞中。通过本文p16/Ki-67双染表达与初次阴道镜组织病理学检查结果的实验数据，进一步验证了p16/Ki-67双染检测可作为细胞周期失调的标志物，有助于识别病变细胞。与Van Zummeren等［18］认为的p16与Ki-67双染可孤立于形态学找出“癌变”细胞的研究观点相一致。
尽管根据《WHO女性生殖器官肿瘤学分类（第4版）解读》［11］，CIN被分为LSIL和高度上皮内瘤变（high-grade intraepithelial neoplasia，HSIL）。由于《中国子宫颈癌筛查及异常管理相关问题专家共识（二）》［8］指出CIN2中的p16/Ki-67双染阴性的患者仍然归属于LSIL。为了更精准地与妇科诊治工作相结合，本文仍然进一步把HSIL细分为CIN2和CIN3，分别进一步观察了p16/Ki-67双染检测对HR-HPV阳性而TCT阴性患者的CIN2/CIN3诊断效能。本研究结果显示，当p16/Ki-67检测阳性时，可强烈提示高级别病变，为区分潜在高级别病变提供了客观的检测指标，与许淑霞等［19］的研究结论相同。
文中p16/Ki-67双染阳性率在不同亚型HPV感染组之间的差异，可反映p16/Ki-67双染阳性率与不同亚型HPV感染组的相关性。尤其是对于同时阳性组和HPV16/18亚型组的患者应高度重视，谨慎处理，密切随访，与Rodríguez-Trujillo等［20］和王海瑞等［21］研究认为的p16/Ki-67双染阳性在HPV16/18妇女进展为HSIL/CIN2+和HR-HPV持续存在的风险很高的研究结论基本一致。
尽管约65%的LSIL会自然消退，临床上可仅观察随访［22］。但是对于15%的宫颈病变可能进展的患者的预测价值仍然值得重视。本研究从不同的p16/Ki-67双染结果探讨了组织学LSIL患者的转归，发现p16/Ki-67双染阴性患者的转归结局优于p16/Ki-67双染阳性的患者。因此，对于p16/Ki-67双染阳性的患者，临床上应重点关注，注意运用多学科进行排查，密切追踪复查，及时预测和发现HSIL等病变，做到早诊断、早治疗。本研究结论与王宇华等［23］报道的p16/Ki-67有利于预警宫颈病变转归的观点一致。
p16/Ki-67双染检测作为新兴的宫颈癌筛查技术，取材方式无创，患者依从性好；判读客观明确，可减轻诊断医师的阅片负担；实验过程无需特殊的仪器，可降低运行的成本，适合在各个层级的医院开展，尤其适用于欠发达地区的宫颈癌筛查。本研究结果显示，p16/Ki-67双染检测对于甄别HR-HPV阳性而TCT阴性患者的CIN2/CIN3具有较高的灵敏度和特异度，能够弥补细胞学检查灵敏度的不足，减少漏诊，可明确宫颈病变风险，为临床上宫颈细胞学阴性且HR-HPV阳性的检测结果提供分流管理指导，对于组织学结果为LSIL的患者转归也具有较好的预测价值，具有在临床上推广使用的潜能。

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