液体活检在结直肠癌诊断中的应用进展

癌症是导致人类死亡的重要原因之一，结直肠癌（CRC）作为全球第三大常见癌症，每年会导致约80万人的死亡，严重威胁着人类健康。近年来，随着环境等因素的影响，我国CRC的发病率呈现逐年上升及年轻化的趋势。局限期CRC患者（Ⅰ期和Ⅱ期）5年生存率接近90%，而伴有远处器官转移的晚期CRC患者生存率仅为13.1%，而且CRC起病隐匿，约1/4的患者在首次确诊时就已经发生了转移，在这个阶段，只能选择姑息性治疗，生活质量较差且预后不良，治疗相关的经济负担也显著增加。因此，实现CRC的早期诊断在疾病诊疗体系中具有重要地位，有助于疾病的早期干预和治疗，可以显著改善患者预后，降低死亡率。

针对CRC人群，目前临床常用的筛查手段主要是肠镜检查、粪便隐血试验、肿瘤标志物检测和影像学检查等。肠镜检查可以直接观察肿瘤的位置及形态，获取病变组织进一步行病理学检查，是目前确诊CRC的金标准，但是其存在有创性、受术者操作水平的影响，在临床应用过程中仍存在一定局限性。粪便隐血试验及肿瘤标志物对CRC的诊断缺乏敏感性和特异性，而影像学检查对微小残留病灶和隐匿性转移瘤难以识别。由此，液体活检应运而生并有望弥补这些检查的不足。液体活检是通过对生物源液体（通常是血液）特定成分进行分析，用于癌症诊断、复发监测和预后评估的一种无创活检组织检查技术。液体活检操作方便，可多次重复取样，动态反映疾病变化，避免了肿瘤组织活检的有创性、花费高、结果回报时间长等缺点，一定程度上可以克服肿瘤异质性，更加全面反映患者疾病状态，具有广阔的应用前景。目前，生物源液体特定成分主要包括循环肿瘤细胞（CTCs）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、细胞游离DNA（cfD-NA）、外泌体（Exs）、肿瘤相关血小板（TEPs）及循环肿瘤相关微粒（taMPs）等。本文就上述几种生物源液体特定成分在CRC临床诊断中的应用进行综述，为完善CRC患者的临床诊断提供新思路。

01
CTCs
CTCs是从原发肿瘤病灶中分离出来的肿瘤细胞群，可以游离在患者的外周血中。CTCs主要通过血管内活化、上皮－间质转化（EMT）或原发肿瘤的被动脱落而产生。根据上皮细胞和间质标志物的表达差异，CTCs主要分为三种类型:上皮细胞表型、间质细胞表型和混合表型。肿瘤细胞发生EMT后，细胞粘附分子表达减少，获得间充质细胞表型，增强细胞的运动能力，从而促进肿瘤细胞的侵袭和播散，导致肿瘤的早期转移和复发，因此CTCs间质细胞表型的出现意味着患者预后较差。目前CellSearchTM是FDA批准的唯一一种用于CTCs富集的技术，具有较高的特异性，在早期CRC患者中即可以检测到CTCs的存在。因此，循环系统中CTCs的检测有望成为CRC筛查的指标。

Wan等通过分析438例肠镜确诊的CRC患者，其中111例为癌前病变，发现CTCs检测对癌前病变的诊断敏感性和特异性分别为76.6%和97.3%，327例为CRC，CTCs检测诊断的敏感性和特异性分别为86.9%和97.3%。最新研究表明CTCs检出率与CRC患者分期密切相关，Ⅰ～Ⅳ期检出率分别为81.7%、82.4%、91.6%、93.4%，由此可见随着病情的进展，CTCs的检出率会显著增高。与CRC诊断标准临床方案相比，CTCs对包括癌前病变在内的所有CRC疾病阶段的总体诊断准确率为88%，健康对照组的假阳性率为3.3%，癌症患者的假阴性率为16%。由此可见，CTCs检测在CRC的诊断方面是一种潜在的、可行的新措施。此外，随着靶向治疗的兴起，伴随诊断作为一种新兴的体外诊断技术得到了快速发展。伴随诊断通过评估患者特定生物标记物的表达水平，进而评价靶向药物的治疗效果，对患者选择最佳靶向治疗药物具有重要意义。徐建明团队的一项研究入选了36例接受了PD1单抗（IBI308）治疗的不同类型消化道肿瘤患者，通过对外周血CTCs进行分析，发现PDL1高表达（PDL1+++）的CTCs数目可以预测PD1治疗效果，而且这类细胞比例越高，响应率也越高，因此PDL1+++CTCs高的患者也具有更好的预后。
02
cfDNA和ctDNA
cfDNA是正常细胞、肿瘤细胞以及循环肿瘤细胞等发生凋亡或坏死后释放到血液中的游离DNA片段，不仅存在于肿瘤患者体内，也可以在健康人群的血液中检测到。cfDNA一旦进入外周循环，半衰期很短，很快就会通过肾脏、肝脏和脾脏从体内清除。因此，cfDNA可以实时反映机体全身情况。其中肿瘤来源的DNA被称为ctDNA，主要通过肿瘤细胞凋亡、坏死、CTCs溶解和肿瘤细胞外的活性分泌进入循环。可以存在于患者的血液、滑膜液和脑脊液等液体中，经尿液和粪便排出。通过测量等位基因突变片段可以获得定量信息，可用于肿瘤诊断并反映肿瘤负荷情况。此外，ctDNA在检测微小残留病灶和隐匿性转移瘤以及监测治疗效果等方面均得到了广泛应用。

Luo等通过前瞻性队列研究验证cfDNA在筛查CRC和高危人群方面的应用价值。该研究共纳入801例CRC患者和1 021例正常对照组的cfDNA样本，通过统计方法，以选定的甲基化标志物构建CRC诊断和预测模型，对CRC诊断的敏感性和特异性分别为89.9%和87.5%。预后模型可以有效预测CRC患者的预后和生存期（P＜0.001）。同时还发现了一个单独的ctDNA甲基化标志物cg10673833，在诊断CRC和癌前病变时具有高敏感性（89.7%）和特异性（86.8%）。Wan等通过cfDNA全基因组测序建立分类模型对局限期（Ⅰ，Ⅱ期）CRC诊断的AUC值为0.92（95%CI:0.91～0.93），敏感性和特异性均为85%。Church等对53例CRC患者和1 457例健康志愿者外周血ctDNA基因甲基化水平进行分析发现，血浆SEPT9基因甲基化异常诊断CRC的敏感性为48.2%，特异性为91.5%;对CRCⅠ～Ⅳ期诊断敏感性分别为35.0%、63.0%、46.0%和77.4%，但对晚期腺瘤的诊断敏感性较低（11.2%）。因此，CRC人群筛查试验大规模应用于临床还需要提高对早期癌症和晚期腺瘤诊断的敏感性。
03
Exs
Exs是一种细胞通过胞吐方式分泌至微环境中的囊泡，直径为40～100nm，具有磷脂双分子层膜结构。人体中几乎所有类型的细胞均可通过内分泌或旁分泌的方式释放Exs。因此Exs广泛存在于血浆、唾液、尿液、母乳、羊水、脑脊液等多种体液中。Exs通过其携带的微小RNA（miRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）、环状RNA（cir-cRNA）、DNA以及蛋白质等生物活性成分的转移，在细胞间物质交换和信息交流中发挥重要作用。与正常细胞相比，肿瘤细胞分泌更多的外泌体，而且患者循环系统中的外泌体与肿瘤细胞释放的外泌体具有相似的遗传信息，表明通过对Exs中遗传信息的检测有望成为肿瘤早期筛查的标记物。

与cfDNA相比，Exs携带的基因片段更加丰富而稳定，因此在近几年受到广泛关注。CRC患者Exs中特异性miRNA的异常表达是早期诊断和分期评估的可靠生物标志物。Ogata－Kawata等筛选并鉴定了16个可作为CRC生物标志物的外泌体miRNA，其中miR－1246和miR－23a的敏感性最高，可以达到95%和92%。miR－92a－3p和miR－17－5p诊断CRC患者的AUC达到0.845和0.897。除了能将CRC患者与健康人进行区分，外泌体miRNA还可以区分出转移和非转移患者。与非转移性患者相比，转移性患者外泌体中miR－1229和miR－25－3p，miR－17－5p和miR－92a－3p表达量更高，鉴别的AUC可以达到0.841，0.854。此外Uratani等发现与健康人相比，腺瘤患者的外泌体中miR－29a和miR－21水平升高，特别是外泌体miR－21的AUC值达到了0.77，敏感性为69.8%，特异性为80.0%。其表达水平与息肉的大小和数量也表现出了相关性。此外，Exs中其他非编码RNA即lncRNA和circRNA也被证明与肿瘤发生发展密切相关。Barbagallo等检测了CRC患者Exs中17个lncRNA和31个cir-cRNA，验证了其中1个上调表达的lncRNA:UCA1，下调表达的lncRNA:TUG1，以及上调表达的cir-cHIPK3。发现circHIPK3和UCA1联合诊断的AUC为0.814，敏感性为93%，特异性为64%，TUG1和UCA1联合诊断的AUC为0.9，敏感性为100%，特异性为70%。外泌体中含有的大量核酸、蛋白质等均在CRC患者中显示出了明显特异性，但目前的研究只是冰山一角，需要更多的研究来明确外泌体应用于CRC诊断和预后的可行性，是非常值得深入研究的领域。
04
TEPs
血小板是从骨髓成熟的巨核细胞胞浆脱落下来的小块胞质，在外周血中含量丰富，主要发挥止血作用。最近研究表明，血小板可以促进肿瘤的生长和转移，并且肿瘤患者血小板反应性较高，容易被激活，从而显著增加了血栓的风险。血小板通过摄取肿瘤细胞和肿瘤微环境释放的外泌体，在血小板中发生剪切转化为TEPs。因此TEPs也携带丰富的核酸和蛋白质，包括mRNA、miRNA、ln-cRNA、circRNA等，具有丰富的表达谱。肿瘤患者TEPs表型和功能上的差异增加了它们作为肿瘤标志物的可能性。TEPs作为一种新兴的液体活检技术，可用于泛肿瘤分析、区分肿瘤类型以及肿瘤基因突变的诊断。

Best等通过对283份来自不同癌种患者和健康受试者的血小板mRNA序列进行分析，发现在癌症患者中TEPs内RNA谱发生改变，通过分析RNA谱的基因变化，可以区分228例局限性或者转移性肿瘤及健康体检者，准确率高达96%。不仅如此，TEPs还能区分并定位6种不同的肿瘤类型，其判断原发肿瘤位置的准确率达71%。Yang等通过分析44例CRC患者和55例健康患者的血小板RNA，发现了1 099个表达异常的基因，其中824个上调基因，275个下调基因。其中TIMP1的差异尤其明显，CRC患者血小板中TIMP1RNA水平明显高于健康人或者炎症性肠病患者，研究发现血小板中的TIMP1RNA可以通过血小板传递进入肿瘤细胞中，在肿瘤细胞中被翻译成有功能的蛋白质，从而促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。因此，TIMP1RNA有望作为诊断CRC的新型生物标志物。研究表明无诱因静脉血栓栓塞患者具有较高的肿瘤发生风险，1年内被诊断为肿瘤的概率为4%～7%，而其中30%～60%的患者会因不及时的肿瘤筛查而延误诊断和治疗。针对这类特殊的患者，一项临床研究（NCT02739867）正在进行中，通过检测无诱因静脉血栓栓塞患者血小板的RNA图谱变化，探究TEPs中特定类型的基因对这部分人群进行肿瘤筛查的准确性，这也进一步显示了TEPs在肿瘤诊断领域的巨大潜力。
05
taMPs
细胞微粒（MPs）是细胞外囊泡（EVs）的一种，直径在100～1 000nm之间，是活化或凋亡的细胞以及静止的肿瘤细胞产生的囊泡，通过质膜直接释放至细胞外。在细胞活化或凋亡时，细胞内钙离子浓度升高，凝溶胶蛋白酶、钙蛋白酶被激活分裂细胞骨架。同时激活磷脂双向转运酶，抑制氨基磷脂转位酶，导致磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺从细胞膜外层到细胞膜内部的转移平衡被破坏，从而使膜内磷脂发生不对称缺失。这些细胞骨架和膜表面的变化导致细胞以出芽方式产生MPs。肿瘤细胞通过释放taMPs影响组织因子和表面的磷脂酰丝氨酸的表达，参与肿瘤增殖、转移和肿瘤相关凝血活动。但是检测taMPs需要排除EVs其他成分的影响，包括Exs和凋亡小体等，技术要求较高。

Willms等通过对taMPs研究发现这是一种具有巨大潜力的生物标志物。研究纳入了52例CRC、40例非小细胞肺癌和11例胰腺癌患者与作为阴性对照组的55例健康受试者和43例结节性甲状腺肿患者的血清进行流式细胞学分析，离心分离后对taMPs上的抗原CD147和上皮细胞黏附分子（EpCAM）进行定量分析。结果表明EpCAM在这些实体肿瘤中的总体阳性预测值和阴性预测值分别为79.03%和85.29%，总体敏感性为95.15%，特异性为52.73%。EpCAM、CD147联合检测的总体阳性预测值略高:阳性预测值和阴性预测值分别为80.36%和83.87%，总体敏感性为94.74%，特异性为54.17%，CD147作为单独诊断指标效果较差。在CRC中，EpCAM+CD147+taMPs与肿瘤体积表现出明显相关性，同时根治术后，EpCAM+taMPs明显下降，也提示与肿瘤存在密切相关。因此Ep-CAM+CD147+taMPs以其在肿瘤诊断中较高的敏感性和特异性以及在评估肿瘤负荷和肿瘤治疗效果的良好表现，在未来可能成为液体活检中的重要检查工具。

结语

肿瘤发生是以致癌基因与抑癌基因平衡破坏为特点的多种因素共同作用的结果，通过液体活检识别肿瘤患者所具有特异性标志物，实现对CRC患者的早期、无创诊断，可以改善患者预后降低死亡率。通过对腺瘤等癌前病变筛查及早进行干预可以明显降低CRC发生率。通过伴随诊断为患者选择合适靶向药物实现个体化精准治疗。此外液体活检可以实时监测复发及治疗反应，更加全面评估患者预后。目前液体活检的应用还受到一些技术限制，以及许多成分还处于研究阶段，但随着精准医学的发展，一定会有越来越多的患者从中受益。