FANCD2基因； FANCD2

HGNC 批准的基因符号：FANCD2

细胞遗传学位置：3p25.3 基因组坐标（GRCh38）：3:10,026,437-10,101,932（来自 NCBI）

▼ 克隆与表达

通过对使用聚乙二醇作为融合剂构建的一组体细胞杂交体的研究，Strathdee 等人（1992） 鉴定了 4 个互补组，表明至少有 4 个不同的 FA 基因，其中任何一个的突变都可能导致范可尼贫血表型。

蒂默斯等人（2001） 提出的证据表明 FA 互补组 D 是异质的，由 2 个不同的基因 FANCD1（600185） 和 FANCD2 组成。他们报道了 FANCD2 基因的定位克隆，该基因编码 1,451 个氨基酸的核蛋白，具有 2 种蛋白亚型，并定位到 3p。与其他 FA 蛋白类似，FANCD2 蛋白没有已知的功能域。然而，与其他 FA 基因不同，FANCD2 在拟南芥、线虫和果蝇中高度保守。

▼ 基因功能

加西亚-伊格拉等人（2001） 表明，将 FANCD2 蛋白激活为单泛素化亚型需要含有 FANCA（607139）、FANCC（613899）、FANCF（613897） 和 FANCG（602956） 蛋白的核复合物。在正常细胞中，FANCD2 因 DNA 损伤而被单泛素化，并靶向核灶（点）。激活的 FANCD2 蛋白与乳腺癌易感蛋白 BRCA1（113705） 共定位于电离辐射诱导的病灶和减数分裂染色体的联会复合体中。作者得出结论，FANCD2 蛋白因此提供了 FA 蛋白复合物和细胞 BRCA1 修复机制之间缺失的联系。该途径的破坏会导致 FA 所有亚型所共有的细胞和临床表型。

谷口等人（2002） 确定 FANCD2 是 FA 和 ATM（607585） 损伤反应途径之间的联系。 ATM 在体外磷酸化了 ser222 上的 FANCD2。在电离辐射后，该位点也在体内以 ATM 依赖性方式磷酸化。 S 期检查点的激活需要 FANCD2 的磷酸化。作者确定 FANCD2 在 ser222 上的 ATM 依赖性磷酸化和 FANCD2 在 lys561 上的 FA 途径依赖性单泛素化是调节离散细胞信号传导途径的孤立后修饰。 FANCD2 的双等位基因破坏导致丝裂霉素 C（MMC） 和电离辐射过敏。

通过共免疫沉淀，Nakanishi 等人（2002） 发现了 FANCD2 和 NBS1（602667） 之间的组成性相互作用，并且他们提供了证据表明这些蛋白质在 2 个不同的组装体中相互作用，以介导 S 期检查点和对 MMC 诱导的染色体损伤的抵抗力。 NBS1、ATM 和 MRE11（600814） 是 FANCD2 磷酸化所必需的，以响应辐射诱导的 S 期检查点。 NBS1、MRE11、RAD50（604040） 和 FANCD2 在核灶内的组装是 MMC 抗性所必需的。

侯赛因等人（2004） 使用酵母 2-杂交分析来测试 FANCD2 和参与同源重组修复的几种蛋白质之间的相互作用。 FANCD2 不与 RAD51（179617）、5 个 RAD51 旁系同源物（参见 602774）、RAD52（600392）、RAD54（600392） 或 DMC1（602721） 相互作用。然而，它与 BRCA2（600185） 中高度保守的 C 端位点结合，该位点也与 FANCG/XRCC9（602956） 结合。 FANCD2 和 BRCA2 从人和中国仓鼠野生型细胞的细胞提取物中进行免疫共沉淀，从而证实了相互作用在体内发生。 BRCA2 突变体 CAPAN-1 细胞中 FANCD2 核灶的形成是正常的，这表明 FANCD2 募集到 DNA 修复位点与野生型 BRCA2 功能无关。在用MMC或羟基脲治疗后，FANCD2与RAD51在病灶中共定位，并且在用羟基脲治疗后与PCNA（176740）非常紧密地共定位。侯赛因等人（2004） 表明 FANCD2 可能在细胞对复制叉停滞的反应或复制相关双链断裂的修复中发挥作用，无论原代 DNA 损伤的类型如何。

威尔逊等人（2008） 发现 XRCC3（600675）、BRCA2、FANCD2 和 FANCG 在 FANCG 磷酸化后通过多个成对相互作用形成复合物。他们提出，至少由这 4 种蛋白质组成的复合物可以促进受损 DNA 的同源重组修复。

豪利特等人（2005） 表明，FA 途径因阿菲迪霉素（APH） 和羟基脲的 DNA 复制应激而被强烈激活。作者使用患者来源的 FA 细胞系和靶向 FANCD2 的 siRNA，证明了 FA 途径响应低剂量 APH 的功能要求。在缺乏完整 FA 途径的情况下，染色体缺口和断裂的总数以及 FRA3B（FHIT; 601153） 和 FRA16D（WWOX; 605131） 脆弱位点的断裂数量均显着升高。此外，APH 激活 FANCD2 和 PCNA（176740） 的单泛素化以及 RPA2（179836） 的磷酸化，发出持续 DNA 复制停滞的信号。 APH 处理后，FANCD2-Ub 在 4 小时后与 PCNA 共定位，24 小时后与 RPA2 共定位在离散的核灶中。

Matsushita 等人通过共价修饰并在鸡 B 细胞系中表达重组鸡 Fancd2（2005） 发现 Fancc、Fancg 和 Fancl（608111） 是 FA 核心复合体的组成部分，并且是 Fancd2 单泛素化所必需的。这些 FA 核心复合体蛋白对于单泛素化 Fancd2 的染色质靶向以及染色质结合 Fancd2 在 DNA 修复中的正常功能也是必需的。松下等人（2005） 表明 FANCD2 上的单泛素部分可能主要充当染色质靶向信号。

McCabe 等人使用通过小干扰 RNA 耗尽 ERCC1（126380） 的正常人成纤维细胞和 FA 患者的成纤维细胞（2008） 表明 ERCC1 对于 FANCD2 的单泛素化和泛素化 FANCD2 在 DNA 损伤位点的积累都是必需的。 ERCC1是DNA交联后FANCD2焦点形成所必需的，可以在双链断裂形成后以及在包括双链断裂在内的停滞复制叉上进行修复。麦凯布等人（2008） 得出结论，双链断裂的形成不需要 ERCC1，但激活 FANCD2 进行修复需要 ERCC1。

Tremblay 等人使用酵母 2-杂交和免疫共沉淀测定法（2008） 发现 HES1（139605）（参与造血干细胞自我更新的 NOTCH1（190198） 通路成分）直接与几个 FA 核心复合体成分相互作用，但不与 FANCD2 相互作用。 HeLa 细胞中 HES1 的缺失导致各个 FA 核心成分之间的正常相互作用失败，以及蛋白质水平改变和一些 FA 核心成分的错误定位。 HES1 的缺失还增加了细胞对 MMC 的敏感性，并减少了 MMC 诱导的 FANCD2 单泛素化和 FANCD2 对 MMC 诱导病灶的定位。

克尼普谢尔等人（2009） 使用无细胞系统证明 FANCI（611360）-FANCD2 是 S 期复制耦合链间交联修复所必需的。从提取物中去除 FANCD2 可抑制链间交联附近的溶核切口和病灶外的跨病灶 DNA 合成。逆转这些缺陷需要泛素化的 FANCI-FANCD2。克尼普谢尔等人（2009） 的结论是，当范可尼贫血途径受到损害时，重要的 S 期链间交联修复机制的多个步骤就会失败。

Naim和Rosselli（2009）利用免疫组织化学分析发现，FANCD2在正常人成纤维细胞的有丝分裂过程中表现出动态定位：在有丝分裂开始时，FANCD2被排除在染色体之外并扩散到细胞质中，在细胞末端返回到细胞核中。分配。 FANCD2 也在有丝分裂染色体上的离散病灶处发现，这些病灶似乎是由前一个 S 期期间叉停顿诱导的未解决的病灶。 APH 处理增加了有丝分裂染色体上 FANCD2 和磷酸化组蛋白 H2AX（γ-H2AX; 601772） 焦点的数量，并且这些 FANCD2 和 γ-H2AX 焦点表现出显着的共定位。 FANCD2 和/或 BLM（RECQL3；604610）（一种参与有丝分裂过程中姐妹染色单体分离完成的蛋白质）的敲低，导致 APH 暴露后非着丝粒后期核质桥和微核的类似增加。 Naim 和 Rosselli（2009） 得出结论，FANC 途径促进 BLM 募集到损伤诱导的核质桥，他们假设 FANC 和 BLM 途径合作解决异常染色单体结构并在细胞分裂结束时完成染色单体分离。

Fanconi 途径的一个中心事件是 FANCI-FANCD2 蛋白复合物的单泛素化。刘等人（2010） 描述了 Fanconi 贫血相关核酸酶 FAN1（613534），它以严格依赖于其在 DNA 损伤位点或其附近积累的能力的方式促进链间交联修复，并且依赖于 FANCI-FAND2 复合物的单泛素化。刘等人（2010） 得出结论，单泛素化复合物招募下游修复蛋白 FAN1 并促进 DNA 链间交联的修复。

佩斯等人（2010） 发现范可尼贫血基因 FANCC（613899） 和非同源末端连接（NHEJ） 因子 Ku70（152690） 之间存在遗传相互作用。 FANCC 和 Ku70 的破坏抑制了对交联剂的敏感性，减少了染色体断裂，并逆转了有缺陷的同源重组。 Ku70 直接与游离 DNA 末端结合，使它们进行 NHEJ 修复。佩斯等人（2010） 表明纯化的 FANCD2（范可尼贫血途径的下游效应子）可能通过修饰此类 DNA 底物来拮抗 Ku70 活性。佩斯等人（2010） 得出的结论是，这些结果揭示了 Fanconi 贫血途径在处理 DNA 末端方面的功能，从而将双链断裂修复从失败的 NHEJ 转向同源重组。

龙等人（2011） 报道非洲爪蟾提取物中 DNA 双链断裂产生的断裂姐妹染色单体通过 RAD51（179617） 依赖性链侵入再生姐妹中进行修复。重组作用于 FANCI（611360）-FANCD2 的下游，但 RAD51 孤立于 FANCI 和 FANC2 并且在双链断裂形成之前结合链间交联-停滞的复制叉。龙等人（2011） 得出的结论是，他们的结果阐明了范可尼贫血途径和链间交联修复过程中重组机制之间的功能联系。此外，他们的结果表明，通过体外同源重组可以完全修复双链断裂。

张等人（2011） 发现 s 泛素结合酶-2W（UBE2W; 614277） 单泛素化 Fancd2。人类细胞系中UBE2W的下调显着减少了由紫外线照射引起的FANCD2单泛素化，但不减少由DNA交联剂丝裂霉素C引起的FANCD2单泛素化或通常在S期发生的FANCD2单泛素化。

Lachaud 等人使用一系列突变型 Fan1 和 Fancd2 构建体以及野生型和突变型小鼠胚胎成纤维细胞（2016） 发现 Fan1 的核酸酶活性，而不是其与泛素化 Fancd2 的相互作用，是 Fan1 依赖性 DNA 链间交联修复所必需的。然而，Fan1 需要其核酸酶活性及其与泛素化 Fancd2 的相互作用来抑制 DNA 中的停滞叉并防止随后的染色体异常。

▼ 生化特征

晶体结构

乔等人（2011） 以 3.4 埃分辨率测定了 FANCI-FANCD2（ID） 复合物的晶体结构。大约 300 kD ID 复合物的结构揭示了单泛素化和调节性磷酸化位点对应到 I-D 界面，表明它们发生在单体蛋白或开放的复合物上，并且它们可能有助于稳定 I-D 异二聚化。 FANCI-DNA 晶体的 7.8 埃电子密度图和体外数据表明，每种蛋白质都具有单链和双链 DNA 的结合位点，表明 ID 复合物识别因复制叉相遇而产生的 DNA 结构具有链间交联。

冷冻电子显微镜

Wang 等人使用冷冻电子显微镜（2020） 确定了与 DNA 结合的单泛素化人类 ID 复合物，并揭示它形成一个围绕 DNA 的闭合环。通过与链间交联 DNA 结合的非泛素化 ID 复合物的结构进行比较，他们发现单泛素化通过一个原聚体的泛素与另一个原聚体以相互的方式结合，触发开放式、槽状 ID 结构的完全重排。这些结构与生化数据一起表明，单泛素化 ID 复合物失去了对链间交联和相关分支 DNA 结构的偏好，并成为可以协调后续修复反应的滑动 DNA 夹。

▼ 基因结构

蒂默斯等人（2001）确定FANCD2基因包含44个外显子。

▼ 测绘

惠特尼等人（1995） 使用微细胞介导的染色体转移将范可尼贫血的 D 组形式对应到 3p。来自 FACD 患者的新永生化成纤维细胞系被用作染色体转移的受体。这些细胞被称为 PD20，保留了 FA 细胞的所有表型特征，包括对丝裂霉素 C 和二环氧丁烷的敏感性。通过连锁分析进行作图是不可能的，因为 DNA 样本仅来自 2 个小型 FACD 家族。然而，通过功能互补将其象征为 FAD 的基因定位到染色体 3，允许使用带有删除各个片段的染色体 3 微细胞杂交来排除该染色体的区域。他们排除了 28 个标记；未排除的所有 13 个标记均位于 D3S1619 和 D3S1307 之间，该区域跨越 3p26-p22，因此可能包含 FAD 基因。他们指出，该区域跨度约为 50 cM，包含至少 25 个基因。其中，2 个与 DNA 修复有关：XPC（613208），位于 3p25，和 RAD23B（600062），位于 3p25.1。

海吉娜等人（2000） 将 FANCD 基因的定位细化到 3p25.3 上的 200 kb 区域。他们使用非互补微细胞杂交体来识别缩小 FANCD 关键区域的小的重叠缺失。

▼ 动物模型

张等人（2010）发现Fancd2 -/- 小鼠血液中血小板数量明显减少，但其他血液学参数均在正常范围内，没有贫血迹象。 Fancd2 -/- 小鼠的骨髓中 Kit（164920） 和 Sca1（Ly6a） 阳性谱系（KSL） 细胞的频率降低了 50%，导致造血干细胞库变小，淋巴祖细胞频率降低。当在正常饲养层/基质层上培养时，Fancd2 -/- KSL 细胞表现出受损的再增殖能力，并且比野生型细胞形成更少的集落。类似地，Fancd2 -/- 骨髓饲养层对祖细胞生长的支持不如野生型饲养层。具有 G2 DNA 含量的 Fancd2 -/- KSL 细胞数量几乎是野生型的两倍，表明失去了静止状态。用抗氧化剂白藜芦醇处理可以使 Fancd2 -/- 细胞的静止、集落形成和细胞周期状态部分正常化，但对野生型细胞没有影响。

朗之万等人（2011） 发现范可尼贫血 DNA 修复途径可以抵消乙醛诱导的小鼠遗传毒性。他们的结果表明，乙醛分解酶 Aldh2（100650） 对于 Fancd2 缺失胚胎的发育至关重要。然而，具有乙醛分解代谢能力的母亲（Aldh2 杂合子）可以支持双突变 Aldh2-null/Fancd2-null 小鼠的发育。然而，这些胚胎对子宫内的乙醇暴露异常敏感，出生后双缺陷小鼠的乙醇消耗迅速导致骨髓衰竭。最后，Aldh2-null/Fancd2-null小鼠自发患上急性白血病。朗之万等人（2011） 得出的结论是，乙醛介导的 DNA 损伤可能对胎儿酒精综合征的发生以及范可尼贫血患者的正常发育、造血功能衰竭和癌症易感性产生重要影响。

加雷科切亚等人（2012） 报道称，未患白血病的老年 Aldh2-null/Fancd2-null 突变小鼠会自发患上再生障碍性贫血，并伴随造血干细胞和祖细胞（HSPC） 库中受损 DNA 的积累。出乎意料的是，他们发现只有 HSPC，而不是更成熟的血液前体细胞，需要 Aldh2 来防止乙醛毒性。此外，通过 Aldeflor 染色测量，HSPC 的醛氧化活性是由 Aldh2 引起的，并与这种保护相关。最后，缺乏范可尼贫血途径介导的 DNA 修复和乙醛解毒的小鼠的 HSC 池减少了 600 多倍。因此，Garaycoechea 等人（2012） 得出结论，范可尼贫血中骨髓衰竭的出现可能是由于醛介导的遗传毒性仅限于 HSPC 库。

▼ 等位基因变异体（5 个精选示例）：

.0001 FANCONI 贫血，补充组 D2
FANCD2、ARG1236HIS

在来自范可尼贫血互补组 D2（227646） 家族的 PD20 细胞系中，Timmers 等人（2001） 在 FANCD2 基因的核苷酸 3707 处发现了 G 到 A 的转变，导致 arg1236 到 his（R1236H） 的取代。这种突变不是常见的多态性，而是遗传自父亲。该家族中发现的母源突变是核苷酸 376（613984.0002） 处的 A 到 G 转变。

.0002 FANCONI 贫血，补充组 D2
FANCD2，376A-G

在来自范可尼贫血互补组 D2（227646） 家族的 PD20 细胞系中，Timmers 等人（2001） 在 FANCD2 基因的核苷酸 376 处发现了 A 到 G 的转变，导致 Ser126 到甘氨酸（S126G） 的取代。该突变还导致异常剪接，并通过利用隐秘剪接位点将内含子 5 的 13 bp 插入到 mRNA 中。 43 个具有该突变的孤立克隆 RT-PCR 产物中有 43 个（100%） 包含此插入，而 31 个对照 cDNA 克隆中只有 1 个（3%） 显示错误剪接的 mRNA。 13 bp 的插入产生了移码并预测了 180 个氨基酸的严重截短的蛋白质。该突变不是常见的多态性，是从母亲遗传的。该家族中发现的父本突变是 arg1236 到 his 的取代（613984.0001）。

.0003 FANCONI 贫血，补充组 D2
FANCD2、ARG302TRP

在范可尼贫血互补组 D2（227646） 家族的 VU008 细胞系中，Timmers 等人（2001） 在 FANCD2 基因的核苷酸 904 处发现了 C 到 T 的转变，导致 arg302 到 trp（R302W） 的取代。这不是常见的多态性，是从父亲那里继承的。母系遗传突变是 gly320-to-ter 取代（613984.0004）。

.0004 FANCONI 贫血，补充组 D2
FANCD2、GLN320TER

在范可尼贫血互补组 D2（227646） 家族的 VU008 细胞系中，Timmers 等人（2001） 在 FANCD2 基因的核苷酸 958 处发现了 C 到 T 的转变，导致 gln320 到 ter（Q320X） 的取代。这不是常见的多态性，是从母亲遗传的。父系遗传突变是 arg302 替换为 trp（613984.0003）。

.0005 FANCONI 贫血，补充组 D2
FANCD2、EX17 DEL

Timmers 等人在来自 Fanconi 贫血补充组 D2（227646） 患者的 PD733 细胞系中（2001） 通过 RT-PCR 鉴定出 FANCD2 外显子 17 的缺失导致蛋白质内部缺失。未发现该患者的基因组改变。 PD733不表达任何FANCD2蛋白。