无名指蛋白，LIM 域相互作用； RLIM

环指蛋白 12； RNF12
环锌指蛋白NY-REN-43抗原

HGNC 批准的基因符号：RLIM

细胞遗传学位置：Xq13.2 基因组坐标（GRCh38）：X:74,582,976-74,614,624（来自 NCBI）

▼ 说明

X连锁的RLIM基因，也称为RNF12，编码一种广泛表达的、具有多种细胞功能的含锌指蛋白。该蛋白作为辅助因子促进或抑制转录因子活性，还充当 E3 泛素连接酶，使靶蛋白泛素化，随后被蛋白酶体降解（Frints 等人总结，2019）。

RNF12 是一种 RING-H2 锌指蛋白，充当 LIM 同源域转录因子的负共调节因子（Bach 等，1999）。 RNF12 还参与启动 X 染色体失活（Jonkers 等，2009）。

▼ 克隆与表达

斯坎兰等人（1999）通过筛选肾细胞癌患者的自体抗体识别的抗原，孤立出人RNF12 cDNA。

Ostendorff 等人使用 PCR 技术（2000）扩增了编码推导的 624 个氨基酸蛋白的 RNF12 cDNA，该蛋白分别与小鼠和鸡 Rlim 蛋白具有 89% 和 85% 的序列同一性。 Northern 印迹分析检测到小鼠 Rnf12 的广泛表达。

▼ 基因功能

巴赫等人（1999）表明小鼠 Rnf12 结合 LIM 结构域并通过招募 Sin3A（607776）-组蛋白脱乙酰酶（分别参见 602949 和 601241）辅阻遏物复合物充当负辅调节子。通过对鸡翅膀发育的体内研究，他们观察到 Rnf12 的过度表达会导致异常的肢体表型，类似于抑制 LIM 同源域因子 LHX2（603759）后观察到的结果。

Ostendorff 等人使用瞬时共转染（2000）证明小鼠 Rnf12 的近端启动子可以在体外被普遍存在且更严格表达的转录因子激活，包括哺乳动物 Kruppel 样转录因子（参见 600599）、Sox（参见 602148）和 ets 相关蛋白（参见 164720））和 RBPJ（147183），Notch（190198）信号转导途径的介导蛋白。奥斯坦多夫等人（2000）假设 Rnf12 的表达水平可能受到 Notch 信号转导途径影响的调节。

奥斯坦多夫等人（2002）检查了 RLIM 作为 DNA 结合转录因子上辅因子交换的介体。 SDS-PAGE 和突变分析显示，依赖于 RING 指的 RLIM 在 UBCH5（602961）存在的情况下被泛素化。然而，RLIM 无法泛素化 LHX1（601999）、LHX3（600577）或 ISL1（600366）转录因子。 RLIM 可有效地泛素化 LMO2（180385）和 LMO4（603129），但仅在不存在 CLIM1（603450）或 CLIM2（603451）的 LIM 相互作用域的情况下进行。在存在或不存在 LMO2 或 LHX3 的 RLIM 存在下，CLIM 蛋白本身被特异性多泛素化。蛋白质印迹分析和荧光显微镜显示，CLIM 的蛋白酶体降解取决于 RLIM RING 指的存在，并且 RLIM 和 CLIM 水平相互相关。对 RLIM 突变或截短形式的分析表明，相互作用结构域仅限于大约 100 个氨基酸的基本进化保守且位于中心的区域。 EMSA 和体外泛素化分析以及染色质免疫沉淀分析相结合，表明 RLIM 依赖于环指的存在，能够泛素化与 DNA 结合的 LHX3 相关的 CLIM 辅因子。奥斯坦多夫等人（2002）提出了一个辅因子交换模型，该模型取决于这些成分的核浓度和其他 LIM 域相互作用伙伴的可用性。

雌性细胞中 X 染色体失活（XCI）的启动以 XIST（314670）转录上调为标志，XIST（314670）是一种非编码、剪接和多腺苷酸化 RNA，它在失活的 X 染色体（Xi）上扩散，同时吸引沉默过程所需的蛋白质复合物。 Jonkers 等人通过筛选表达 BAC 的雄性和雌性转基因小鼠胚胎干（ES）细胞系，覆盖小鼠或人 XIST 周围的 10 Mb 区域（2009）发现 RNF12 参与计算每个细胞核的活跃 X 染色体数量并触发随机 XCI。 Rnf12 ORF（小鼠和人类 XIST 的端粒）的破坏导致雌性 ES 细胞缺乏 Xist 表达和 XCI。相反，小鼠或人 RNF12 的过度表达以剂量依赖性方式升高 Xist 表达和 XCI，导致雄性细胞显示 Xi，雌性细胞显示 2 Xi。免疫组织化学分析表明，在雌性 ES 细胞中，Rnf12 定位于细胞核，但不定位于 Xi。 Western blot 分析显示，在 XCI 启动之前和启动过程中，Rnf12 在雌性 ES 细胞中的表达量高于雄性 ES 细胞。雄性和雌性小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中 Rnf12 表达水平没有差异，表明雌性 MEF 中 1 个拷贝的 Rnf12 失活。

申等人（2010）通过对小鼠卵母细胞进行 Rnf12 条件性敲除（其中 Rlim 积累到高水平）表明，突变 X 染色体（δ-m）的母体传递会导致雌性胚胎因印迹 X 染色体缺陷而致死失活。他们提供的证据表明，在 δ-m 雌性胚胎中，Xist 云的最初形成和 Xp 沉默受到抑制。相比之下，缺乏 Rlim 的胚胎干细胞能够形成 Xist 云，并在随机 X 染色体失活过程中沉默至少一些 X 连锁基因。申等人（2010）得出的结论是，他们的结果将 Rnf12/Rlim 的母体沉积物赋予了启动小鼠印记 X 染色体失活的关键功能。

纳瓦罗等人（2011）指出，Nanog（607937）、Oct4（POU5F1; 164177）和 Sox2（184429）（支持小鼠 ES 细胞多能性的 3 个主要转录因子）部分通过直接与 Xist 内含子结合来维持 Xist 抑制直至分化1.纳瓦罗等人（2011）发现这些转录因子也靶向并抑制 Rnf12。他们得出结论，Rnf12 下调对于维持未分化小鼠 ES 细胞中的 Xist 沉默至关重要。

贡坦等人（2012）确定多能因子 REX1（614572）是 X 染色体失活机制中 RNF12 的关键靶标。 RNF12 导致 REX1 泛素化和蛋白酶体降解，Rnf12 敲除小鼠胚胎干细胞显示 Rex1 水平增加。使用染色质免疫沉淀测序，在 Xist 和 Tsix（300181）调控区域中检测到 Rex1 结合位点。研究发现，雌性胚胎干细胞中 Rex1 的过度表达会抑制 Xist 转录和 X 染色体失活，而雄性 Rex1 +/- 胚胎干细胞则表现出异位 X 染色体失活。由此，Gontan 等人（2012）提出 RNF12 通过剂量依赖性催化作用导致 REX1 分解，从而代表启动 X 染色体失活的重要途径。 Rex1 和 Xist 仅存在于胎盘哺乳动物中，这表明这两个基因的共同进化和 X 染色体失活。

申等人（2014）表明，在经历随机 X 染色体失活（rXCI）的小鼠胚胎细胞中，Rlim 水平下调。申等人（2014）证明，从植入前阶段开始缺乏 Rlim 的雌性细胞显示出 XCI 的特征，包括 Xist（314670）云和 H3K27 三甲基化灶，并且具有完整的胚胎发生潜力。申等人（2014）得出的结论是，这些结果提供了 Rlim 对于 rXCI 可有可无的证据，表明在小鼠中，孤立于 Rlim 的机制激活了胚胎中的 Xist。

▼ 基因结构

奥斯坦多夫等人（2000）确定小鼠 Rnf12 基因至少包含 5 个外显子，跨越约 20 kb 的基因组 DNA。

▼ 测绘

通过 FISH，Ostendorff 等人（2000）将 RNF12 基因定位到染色体 Xq13-q21，这与他们将小鼠 Rnf12 基因定位到 X 染色体的情况一致。人类染色体 15q21-q22 上的第二个荧光信号被认为反映了密切相关基因的存在。

▼ 分子遗传学

Tonne 等人在患有 Tonne-Kalscheuer 综合征（TOKAS; 300978）的挪威第 3 代家庭的 4 名男性中（2015）鉴定了 RLIM 基因中的半合子错义突变（Y356C; 300379.0001）。该变异是通过全外显子组测序发现的，与该家族中的疾病分离。

Hu 等人在来自 3 个不相关家庭的 TOKAS 受影响男性中（2016）在 RLIM 基因中鉴定出 3 个不同的半合错义突变：P587R（300379.0002）、R387C（300379.0003）和 R599C（300379.0004）。这些突变是通过 X 染色体外显子组测序发现的，并与家族中的疾病分开。没有进行变体的功能研究。

在来自 4 个不相关家族（家族 C、E、G 和 I）的受 TOKAS 影响的男性个体中，Frints 等人（2019）鉴定了 RLIM 基因中的 4 个不同的半合子错义突变：R365C（300379.0005）、D598N（300379.0006）、R611C（300379.0007）和 Y577H。另一个具有相似表型的男孩（A 族）携带意义不明的半合子 P77L 变异。这些突变是通过全基因组或全外显子组测序发现的，并与家族中的疾病分离，包括未受影响或轻度受影响的女性携带者。弗林茨等人（2019）还回顾了 Tonne 等人报道的 4 个家族，他们将其称为 B、D、F 和 H 家族（2015）和胡等人（2016）。所有报告的突变均发生在外显子 5 中，P77L 除外，P77L 位于外显子 4 中。三个突变（Y356C、R365C 和 R387C）位于推定的基本结合域中，HEK293 细胞中的体外功能表达研究显示 RLIM 泛素连接酶略有增加与野生型相比，这些变体产生的活性。对 C 端催化 RING-H2 锌指结构域中发生的 4 个额外突变（P587R、D598N、R599C 和 R611C）进行的类似研究导致泛素连接酶活性与野生型相比降低。没有明显的基因型/表型相关性。将错义变体表达到敲低 rlim 基因的斑马鱼中，未能挽救小头畸形表型，这表明它们都导致了功能丧失效应。对 14 名女性携带者细胞的分析显示，与对照组相比，X 失活高度倾斜（87-100%），可能导致突变等位基因沉默。

▼ 动物模型

弗林茨等人（2019）发现使用吗啡啉敲低和 CRISPR/Cas9 基因编辑敲低斑马鱼 rlim 同源物会导致小头畸形。

▼ 等位基因变异体（7 个精选示例）：

.0001 TONNE-KALSCHEUER 综合症
RLIM，TYR356CYS

Tonne 等人在患有 Tonne-Kalscheuer 综合征（TOKAS; 300978）的挪威第 3 代家庭的 4 名男性中（2015）在 RLIM 基因中发现了一个半合子 c.1067A-G 转换（c.1067A-G，NM_183353.2），预测该蛋白的保守区域内有 tyr356 到 cys（Y356C）的取代，这对于绑定到 LIM 域。该变异是通过全外显子组测序发现并经桑格测序证实的，与该家族中的疾病分离。在 dbSNP 和 Exome Variant Server 数据库或 100 个挪威对照中未发现它。杂合子女性携带者的 X 失活模式极其扭曲。没有进行变体的功能研究和患者细胞的研究。

.0002 TONNE-KALSCHEUER 综合症
RLIM，PRO587ARG

Hu 等人在来自患有 Tonne-Kalscheuer 综合征（TOKAS; 300978）的家庭（T11）的 6 名受影响男性中（2016）在 RLIM 基因中发现了半合子 G 到 C 的颠换（chrX.73,811,390G-C, GRCh37），导致 pro587 到 arg（P587R）的取代。家庭中几名未受影响的女性被发现是这种突变的携带者。该突变是通过 X 染色体外显子组测序发现的，并针对 dbSNP（版本 135）、外显子组变异服务器、1000 个基因组计划数据库以及 200 个丹麦外显子组进行了筛选。没有对该变体进行功能研究。 Kalscheuer（2016）指出，受影响的家庭成员患有轻度至重度智力障碍，并伴有不同的行为问题。

.0003 TONNE-KALSCHEUER 综合症
RLIM，ARG387CYS

Hu 等人在 1 名来自 Tonne-Kalscheuer 综合征（TOKAS; 300978）家族的男性（D72）中（2016）在 RLIM 基因中发现了一个半合子 G 到 A 的转变（chrX.73,811,991, GRCh37），导致 arg387 到 cys（R387C）取代。家庭中几名未受影响的女性被发现是这种突变的携带者。该突变是通过 X 染色体外显子组测序发现的，并针对 dbSNP（版本 135）、外显子组变异服务器、1000 个基因组计划数据库以及 200 个丹麦外显子组进行了筛选。没有对该变体进行功能研究。 Kalscheuer（2016）指出，受影响的家庭成员患有智力障碍、小头畸形、小颌畸形和隐睾。

.0004 TONNE-KALSCHEUER 综合症
RLIM，ARG599CYS

Hu 等人在患有 Tonne-Kalscheuer 综合征（TOKAS; 300978）的家族（AU31）的 2 名男性中（2016）在 RLIM 基因中发现了 G 到 A 的转变（chrX.73,811,355G-A, GRCh37），导致 arg599 到 cys（R599C）取代。该突变是通过 X 染色体外显子组测序发现的，并针对 dbSNP（版本 135）、外显子组变异服务器、1000 个基因组计划数据库以及 200 个丹麦外显子组进行了筛选。没有对该变体进行功能研究。 Kalscheuer（2016）指出，这些患者患有轻度至中度智力障碍。

.0005 TONNE-KALSCHEUER 综合症
RLIM、ARG365CYS

在来自澳大利亚家庭（家庭 C，AU38）的 2 名患有 Tonne-Kalscheuer 综合征（TOKAS；300978）的男性患者中，Frints 等人（2019）鉴定了 RLIM 基因中的半合子 c.1093C-T 转换（c.1093C-T，NM_183353.2），导致结合域中的保守残基处的 arg365 至 cys（R365C）取代。这种突变是通过 X 染色体外显子组测序发现的，在几位女性携带者中也发现了这种突变，并与该疾病在家族中分离。体外功能表达研究表明，与野生型相比，该变异体导致RLIM泛素化活性略有增加，但无法通过敲除rlim基因来挽救斑马鱼的异常表型，这表明存在功能丧失效应。

.0006 TONNE-KALSCHEUER 综合症
RLIM，ASP598ASN

在来自比利时家庭（G 家族）的 2 名有母系亲属的患有 Tonne-Kalscheuer 综合征（TOKAS；300978）的男性个体中，Frints 等人（2019）在 RLIM 基因中鉴定出半合子 c.1792G-A 转换（c.1792G-A，NM_183353.2），导致 RING-H2 锌中的保守残基处由 asp598 替换为 asn（D598N）手指域。这种突变是通过全外显子组测序发现的，也在几名女性携带者中发现，并与该疾病在家族中分离。体外功能表达研究表明，该变异体导致RLIM泛素化活性降低，无法挽救敲除RLIM基因的斑马鱼的异常表型，提示存在功能丧失效应。

.0007 TONNE-KALSCHEUER 综合症
RLIM，ARG611CYS

在来自科索沃-阿尔巴尼亚裔家庭（家庭 I）的 4 名患有 Tonne-Kalscheuer 综合征（TOKAS；300978）的男孩中，Frints 等人（2019）在 RLIM 基因中鉴定出半合子 c.1831C-T 转换（c.1831C-T，NM_183353.2），导致 RING-H2 锌中的保守残基处的 arg611 至 cys（R611C）取代手指域。这种突变是通过全基因组测序发现的，在女性携带者中也发现了这种突变，并且与该疾病在家族中分离。体外功能表达研究表明，该变体导致RLIM泛素化活性降低，并且无法挽救敲除rlim基因的斑马鱼的异常表型，提示存在功能丧失效应。弗林茨等人（2019）指出，该家庭中的一名受影响男孩已被 J. P. Fryns 教授亲自临床诊断为 Fryns 综合征（229850）。