X 失活特异性转录反义； TSIX

XIST-ANTISENSE

HGNC 批准的基因符号：TSIX

细胞遗传学位置：Xq13.2 基因组坐标（GRCh38）：X:73,792,205-73,829,231（来自 NCBI）

▼ 克隆与表达

在哺乳动物中，剂量补偿是通过 X 失活实现的，并由 X 失活中心（XIC）顺式调节（参见 XIST；314670）。 XIC 控制 X 染色体计数、X 失活的选择以及沉默的启动。 XIC 活性最终导致 XIST RNA 的特性发生变化，从不稳定、稀缺的 RNA 转变为覆盖未来失活 X 染色体的高度表达的 RNA。删除位于 Xq13.2 上的 XIST 下游的 65 kb 区域，会导致 XIST 的组成型表达和 X 失活，表明存在顺式调控元件。

当使用链特异性探针通过 RNA FISH 检查胚胎干（ES）细胞中的 Xist 表达时，Lee 等人（1999）鉴定出 Xist 的反义基因。反义信号是精确的，定位于 Xic，并在雄性、雌性和转基因 ES 核中发现。李等人（1999）将反义基因称为“Tsix”。 Tsix 是一种 40 kb RNA，起源于 Xist 下游 15 kb 处，具有识别其 5 素起始位置的 CpG 岛，并在 Xist 基因座上转录。 Tsix 序列在人类 XIC 中是保守的。小鼠 Xist 和人类 XIST 基因在 Xist 6200-10200 bp 上有 63.5% 相同； Tsix 的 5-质数三分之一的区域与 XIC 中的相同区域有 45.3% 至 56.7% 的相同性。 Tsix RNA 没有保守的开放解读码组，仅在细胞核中可见，并且位于 Xic 处。在小鼠雌性 ES 细胞中，在 X 失活开始之前，两条 X 染色体上的 Tsix 均以低水平表达。在 X 失活开始时，Tsix 表达变成单等位基因，与未来的活性 X染色体连锁，并持续存在，直到 Xist 关闭。一旦细胞进入 X 失活途径，失活 X 上就不会发现 Tsix。李等人（1999）得出结论，Tsix 具有的特征表明其在调节 X 失活的早期步骤中发挥作用，但在沉默步骤中没有作用。

Migeon 等人使用携带人类 XIC 和 RT-PCR 转基因的鼠 ES 细胞（2001）鉴定了人类 TSIX，并随后检测了其在源自人类胚状体的成纤维细胞中的表达。然而，计算机分析确定 TSIX 没有开放解读码组，并且与小鼠 Tsix 几乎没有同源性。五素RACE分析表明，TSIX的转录起始位点可能类似于Tsix外显子2和3，但与Tsix不同，TSIX在其5素末端缺乏适当的CpG岛，这表明存在进化断点。米根等人（2001）得出结论，TSIX 与 Tsix 一样，仅在胚胎来源的细胞中表达，在 XIST 3-prime 末端的下游起始，并产生非翻译的 RNA。该 RNA 从相反的链转录为 XIST，并且部分是 XIST 的反义链。 TSIX 与 Tsix 的不同之处在于，它在 5-prime 末端被截短，不覆盖 XIST 启动子，并且不具有小鼠 Tsix 的 X 失活功能所必需的 CpG 岛。

▼ 基因功能

曹等人（2002）鉴定出绝缘子和转录因子 CTCF（604167）作为小鼠 X 染色体选择的候选反式作用因子。选择/印记中心包含串联 CTCF 结合位点，可在增强子阻断测定中发挥作用。体外结合会因 CpG 甲基化而降低，并因包含非 CpG 甲基化而消除。曹等人（2002）假设 Tsix 和 CTCF 共同建立了一个可调节的表观遗传开关，用于小鼠中的 X 失活。小鼠 Tsix 包含超过 40 个 CTCF 基序，而人类序列则包含超过 10 个。

DXPas34 由包含 Ctcf 基序的 34 bp 重复序列组成，位于小鼠 Tsix 基因 5 引物末端的 CpG 丰富区域内。科恩等人（2007）表明小鼠 Tsix 部分通过 DXPas34 发挥作用。 DXPas34 具有双向启动子活性，产生重叠的正向和反向转录本，并且对于小鼠随机和印记 X 失活都是必需的。系统发育分析显示大鼠 Xic 中存在与 DXPas34 相似的区域。人类直向同源物包含一个更远相关的 16 bp 重复序列，其中包括 CTCF 结合基序。人类序列还具有小鼠 Tsix 中未发现的 14 kb 插入。科恩等人（2007）认为小鼠和人类 TSIX 5 素区中的重复起源于引入 CTCF 识别位点的古老逆转录转座子。

Boumil 和 Lee（2001）回顾了 Xist 和 Tsix 在 X 失活中的作用。

在小鼠胎盘中，X 失活被印记（父本 X 染色体始终不活跃），母本 Xist 等位基因受到 Tsix 基因编码的顺式作用反义转录本的抑制。米根等人（2001）表明人类 TSIX 基因缺乏鼠 Tsix 印记功能所需的关键调控元件。米根等人（2002），使用 RNA FISH 对人类胎儿细胞中的转录本进行细胞定位，表明人类 TSIX 反义转录本无法抑制 XIST。 TSIX 仅从失活的 X 染色体转录并与 XIST 共表达。此外，TSIX 在胎盘组织中没有母体印记，并且其转录在整个胚胎发生过程中持续存在于胎盘和胎儿组织中。因此，小鼠 Tsix 对 Xist 的抑制在人类中没有对应的，并且 TSIX 不是保护活性 X 染色体免于随机失活的基因。由于人类 TSIX 无法在胎盘中印记 X 失活，因此它可以作为小鼠 Tsix 的突变体，从而深入了解印记 X 失活中反义活性的特征。

Migeon（2003）认为小鼠和人类对 X 染色体失活的调节存在很大差异。具体来说，她认为 Tsix 对 Xist 的反义调节仅发生在小鼠中，其中反义 Tsix 在印记和随机 X 失活期间阻断 Xist 表达。作为回应，Lee（2003）得出的结论是，现在断言 Tsix 介导的调节是否为人类和小鼠所共有还为时过早。在她看来，两种生物体中 X 失活的主要基础似乎是相同的。

Okawa 和 Lee（2003）在小鼠 X 失活中心发现了一个调节 Tsix 的顺式元件。他们将这种顺式元件命名为“X-失活基因间转录元件”。或希特。 Xite 含有基因间转录起始位点和具有等位基因差异的 DNase I 超敏感位点。在 X 染色体失活（XCI）开始时，删除 Xite 会下调 Tsix 的顺式和偏态 XCI 比率，表明 Xite 促进 Tsix 在活性 X 上的持久性。截断 Xite RNA 无关紧要，表明 Xite 作用不需要完整的转录本。 Xite 位于 Xist 下游 20 至 32 kb 处。 Okawa 和 Lee（2003）提出等位基因特异性 Xite 作用促进 Tsix 不对称性并产生 X 染色体不平等。因此，Xite 是 Xce 的候选者，Xce 是 XCI 比率的经典修饰符（参见 300074）。

Shibata 和 Lee（2003）报道，在未分化的小鼠胚胎干细胞中，Tsix RNA 的摩尔过量是 Xist RNA 的 10 至 100 倍。此外，只有 30% 到 60% 的 Tsix RNA 在已知的外显子-内含子连接处剪接。 Tsix 在 5 引物末端进行异质剪接，大多数可检测的剪接变体仅表现出正义和反义 RNA 之间 1.9 kb 的互补区域。

佐渡等人（2005）和纳瓦罗等人（2005）孤立确定小鼠 Tsix 通过改变 Xist 位点的染色质结构来沉默 Xist。

徐等人（2006）表明，在小鼠胚胎干细胞中，染色体间配对介导 X 染色体之间的通讯，从而调节 X 失活并确保相互排斥的沉默。配对在 X 失活开始时短暂发生，并且是 X 失活中心特有的。删除 Xite（300074）和 Tsix 会扰乱配对和计数/选择，而它们的常染色体插入会诱导 X 常染色体从头配对。异位 X-常染色体相互作用抑制内源性 X-X 配对并阻止 X-染色体失活的启动。因此，Tsix 和 Xite 均以顺式和反式发挥作用。徐等人（2006）提出 Tsix 和 Xite 通过 X-X 配对调节计数和互斥选择。

Bacher 等人使用 3 维荧光原位杂交分析（2006）表明，在 X 失活之前，2 个 X 失活中心（Xics）在小鼠雌性胚胎干细胞的分化过程中短暂共定位。 Bacher 等人使用能够印记而非随机 X 失活的 Xic 转基因，以及破坏随机 X 失活的 Xic 缺失（2006）证明 Xic 共定位与随机 X 失活中的 Xic 功能相关。 Xics 的瞬时相互作用需要长程序列和 Tsix 元件（生成 Xist 的反义转录物）。巴赫等人（2006）提出，Xics 的瞬时共定位对于细胞确定 Xic 数量并确保 X 失活的正确启动可能是必要的。

小川等人（2008）报道小鼠 Xist（314670）和 Tsix 在体内形成双链体。在 X 染色体失活过程中，双链体被加工成小 RNA，很可能以 Dicer（606241）依赖性方式位于活性 X 染色体上。删除 Dicer 会损害小 RNA 的产生并抑制 Xist。此外，如果没有 Dicer，Xist RNA 就无法积累，并且组蛋白 H3（参见 602810）赖氨酸 27 三甲基化在失活的 X 中被阻断。这些缺陷通过截短 Tsix 得到部分修复。因此，小川等人（2008）得出结论，X 染色体失活和 RNA 干扰相交叉，下调活性 X 染色体上的 Xist 并在失活 X 染色体上遗传沉默。

多诺霍等人（2009）证明 OCT4（164177）位于 X 染色体失活（XCI）层次结构的顶部，并通过触发 X 染色体配对和计数来调节 XCI。 OCT4 直接结合 X 失活中心的 2 个调节性非编码 RNA 基因 TSIX 和 XITE（300074），并通过蛋白质-蛋白质相互作用与 SCI 转因子 CTCF（604167）和 YY1（600013）形成复合物。 Oct4 的缺失会阻断同源 X 染色体配对，并导致雌性小鼠胚胎干细胞中两条 X 染色体失活。多诺霍等人（2009）得出的结论是，他们确定了第一个调节计数的反式因子，并在 X 染色体重编程过程中将新功能归因于 OCT4。

纳瓦罗等人（2010）证明胚胎干细胞中 Tsix 的上调取决于与 Tsix 启动子相关的 DXPas34 小卫星对多能标记 Rex1（ZFP42; 614572）以及重编程相关因子 Klf4（602253）和 Myc（190080）的募集。 DXPas34 耗尽后，3 个因子的结合被消除，转录机制不再有效地招募到 Tsix 启动子。其他分析，包括敲低实验，进一步证明 Rex1 对于 Tsix 的有效转录延伸至关重要。因此，不同的胚胎干细胞特异性复合物将 X 失活重编程和多能性结合起来，Nanog（607937）、Oct4 和 Sox2（184429）抑制 Xist，以促进失活 X 的重新激活，Klf4、Myc 和 Rex1 激活 Tsix重塑 Xist 染色质并确保分化时随机 X 失活。 Navarro 等人通过多能因子调节 Xist/Tsix 的整体模式（2010）指出，复杂的表观遗传过程可以通过专门用于多能性的机制进行一般直接控制。

▼ 动物模型

Lee 和 Lu（1999）在雌性和雄性小鼠细胞中进行了 Tsix 基因的定向删除。尽管缺乏 Tsix RNA，X 染色体计数仍然完整：雌性细胞仍然失活 1 X，而雄性细胞阻止 X 失活。然而，杂合雌性细胞表现出 Xist 表达的偏差和突变体 X 的主要非随机失活。突变体 X 阻止 Xist 积累的能力受到损害。作者得出结论，Tsix 以顺式方式调节 Xist 并决定 X 染色体选择，而不影响沉默。因此，计数、选择和沉默在基因上是分开的。 XX 和 XY 细胞中的对比效应表明，消极和积极因素参与选择活跃和不活跃的 X 染色体。

Lee（2000）提供的证据表明 X 染色体上的印记是由反义 Xist 基因 Tsix 控制的。 Tsix 在母系表达，携带 Tsix 缺失的小鼠表现出正常的父系遗传，但母系遗传受损。母系遗传很少发生，存活的后代表现出宫内生长迟缓和生育能力下降。传输比畸变是由突变胚胎的印记破坏和植入后丢失造成的。与胚胎干细胞中的影响相反，Tsix 的缺失导致早期雄性胚胎中 X 异位失活，以及雌性胚胎中两条 X 染色体失活，表明 X 染色体计数不能覆盖 Tsix 印记。这些结果强调了印记 X 失活和随机 X 失活之间的差异，但表明 Tsix 对两者都有调节作用。 Lee（2000）提出印记中心位于 Tsix 内。

Clerc 和 Avner（1998）将 65 kb 的缺失定位到雌性 ES 细胞系中的 2 个 X 之一，其中包括 Xist 基因的末端和 Tsix 的起始位点。这导致分化的 ES 细胞中缺失的 X 完全失活。莫雷等人（2001）重新检查了 65 kb 缺失的表型，并使用 cre/loxP 位点特异性重新插入策略将 Tsix 和 Xist 的末端外显子定位回删除的基因座。在失活之前，未分化的 ES 细胞中缺失的 X 与 Xist 表达增加和 Xist 转录物扩散远离其合成位点相关。 Tsix 的恢复抑制了 Xist 表达的稳态水平，并将 Xist RNA 限制在其转录位点。在分化的 ES 细胞失活开始时，Tsix 的恢复未能恢复随机 X 失活，尽管顺式 Xist RNA 积累的水平显着降低。作者提出 Tsix 具有双重功能，既可以作为 Xist 表达稳态水平的抑制因子，又可以作为 Xist RNA 在细胞核内分布的调节因子。他们还假设随机失活需要 Xist 顺式抑制之外的机制。

删除小鼠一条 X 染色体上的 Tsix 会使 X 染色体失活偏向于雌性体细胞中突变的 X 染色体。 Lee（2002）生成了纯合 Tsix 缺失小鼠，以测试第二个等位基因的删除如何影响 X 失活的选择。纯合性导致生育率极低，并揭示了两种以前未知的非孟德尔遗传模式。首先，性别比例偏向于女性出生，每 2 至 3 个儿子就有 1 个女儿。其次，在幸存的缺失纯合子小鼠中，X 失活模式意外地恢复为随机。因此，就选择而言，Tsix 突变会在杂合子中产生表型异常，但不会在纯合子中产生表型异常。为了调和雌性丧失与明显回归随机选择的悖论，Lee（2002）提出，删除两个 Tsix 等位基因会导致混乱选择，纯合幸存者的随机性反映了不同 X 染色体活跃和不活跃的偶然选择。

Lee（2005）使用小鼠敲除和转基因分析来鉴定非编码 Tsix 和 Xite 基因内的 DNA 序列作为 X 染色体的分子。 Tsix 纯合子缺陷导致“混乱选择”和可变数量的失活 X，而过量的 Tsix/Xite 会抑制 X 失活。因此，计数受到特定 Tsix/Xite 突变的影响，这表明计数在基因上与选择是分离的，但在分子上与选择相关。这些突变对 XX 和 XY 小鼠细胞的影响不同，表明计数和选择不是由一种阻断因子调节，而是由阻断因子和能力因子共同调节。