无名指和 WD 含有重复结构域的蛋白质 3; RFWD3

HGNC 批准的基因符号：RFWD3

细胞遗传学位置：16q23.1 基因组坐标（GRCh38）：16:74,621,399-74,666,877（来自 NCBI）

▼ 说明

RFWD3 是一种 E3 泛素连接酶，与复制蛋白 A 复合物（参见 RPA1，179835）相关并通过稳定 p53（TP53；191170）参与 DNA 损伤反应（Liu 等人的总结，2011）。

▼ 克隆与表达

傅等人（2010）从 HeLa 细胞 cDNA 文库中克隆了全长人类 RFWD3。推导的 774 个氨基酸的蛋白质包含一个 N 端富含 SQ 的区域，随后是一个 RING 结构域、一个卷曲螺旋结构域和一个 C 端 WD40 结构域。

刘等人（2011）发现 RFWD3 富含 SQ 的 N 端结构域（称为 SSQ 结构域）由 3 个近乎完美的 17 个氨基酸重复组成，其中包括基序 SSQ。

▼ 基因功能

在未受应激的细胞中，p53 被 E3 泛素连接酶 MDM2（164785）多泛素化，并成为蛋白水解降解的目标。然而，作为对 DNA 损伤的反应，p53 变得稳定并激活细胞周期停滞和细胞凋亡所必需的转录程序。傅等人（2010）发现 RFWD3 可以稳定 p53 以应对 DNA 损伤。 RFWD3 与 MDM2 和 p53 形成复合物，并与 MDM2 协同作用，对 p53 进行单泛素化，但这种相互作用限制了 MDM2 通过延长多泛素链来破坏 p53 的稳定性。 RFWD3 还被检查点激酶 ATM（607585）和 ATR（601215）磷酸化，这进一步增强了 DNA 损伤后 p53 单泛素化。傅等人（2010）得出结论，RFWD3 是一种 E3 泛素连接酶，当 G1 细胞周期检查点激活时，它可以稳定 p53。

通过串联亲和纯化 293T 细胞，然后进行质谱分析，Gong 和 Chen（2011）发现 RFWD3 与 RPA 复合物共纯化，RPA 复合物在 DNA 损伤位点结合并稳定单链 DNA。体外 Pull-down 测定显示 RFWD3 与 RPA2（179836）特异性相互作用，但不与 RPA1 或 RPA3（179837）相互作用。使用截短和内部缺失突变体揭示了 RFWD3 的卷曲螺旋结构域与 RPA2 C 末端附近的结构域特异性相互作用。免疫组织化学分析表明，RFWD3 与 RPA2 共定位于羟基脲诱导的 DNA 损伤灶处。通过小干扰 RNA 敲低 RFWD3 导致 DNA 损伤后检查点蛋白 CHK1（CHEK1; 603078）磷酸化失败。无法与 RPA2 相互作用的 RFWD3 突变体和缺乏 E3 泛素连接酶 RING 结构域的 RFWD3 突变体也观察到 CHK1 激活失败。 RFWD3 的缺失导致对羟基脲过敏。 Kong 和 Chen（2011）得出结论，RFWD3 的 E3 泛素连接酶活性对于复制检查点至关重要。

刘等人（2011）发现，在正常生长的人类细胞的 S/G2 期，RFWD3 部分定位于 PML（102578）核存储体，并以 RPA 依赖性方式易位到 DNA 损伤位点。 RFWD3 通过其卷曲螺旋结构域和 WD40 重复序列直接与 RPA2 相互作用，并且需要这种相互作用才能在 DNA 损伤位点积累。 RFWD3 或 RPA2 的敲低都会减弱这两种蛋白质的磷酸化。 RFWD3 的缺失延迟了响应复制阻断的 RAD51（179617）焦点形成，并与 RAD51 和磷酸化 H2AX（601772）焦点的持续存在相关，表明 DNA 修复有缺陷。

▼ 测绘

Hartz（2011）根据 RFWD3 序列（GenBank AK001382）与基因组序列（GRCh37）的比对，将 RFWD3 基因对应到染色体 16q23.1。

▼ 分子遗传学

Knies 等人对一名 12 岁德国女孩（患者 1143）进行了研究，该女孩的父母无关，患有范可尼贫血补充 W 组（FANCW；617784）（2017）鉴定了 RFWD3 基因中的复合杂合突变（c.205_206dupCC, 614151.0001 和 I639K, 614151.0002）。在暴露于丝裂霉素 C（MMC）和其他 DNA 交联剂后，患者细胞表现出染色体断裂增加、存活率降低和细胞周期停滞在 G2 期，这些缺陷可以通过表达野生型 RFWD3 来恢复。具体结果表明 BRCA2（600185）依赖性同源重组（HR）存在缺陷。 I639K 变体的体外研究表明，与野生型相比，它对细胞核和染色质的重定位较少，破坏了与 RPA 蛋白的物理相互作用（参见，例如 RPA2，179836），并导致转导细胞中的 HR 受损。产生 RFWD3 突变体的三种不同细胞模型概括了在患者细胞中观察到的缺陷，表明 RFWD3 通常促进 DNA 链间交联诱导的 HR。克尼斯等人（2017）得出结论，RFWD3 位于 FA/BRCA 通路的后期，BRCA2/FANCD1 的下游。

▼ 动物模型

克尼斯等人（2017）发现 Rfwd3 缺失小鼠能够存活，并且没有表现出明显的表型异常，尽管有一些证据表明胚胎致死率增加、早期死亡和生育力低下，与突变小鼠的睾丸和卵巢萎缩有关。突变小鼠胚胎成纤维细胞对 DNA 交联剂高度敏感，并且与对照相比，染色体断裂增加。

▼ 等位基因变异体（2 个选定示例）：

.0001 FANCONI 贫血，补充组 W（1 名患者）
RFWD3，2-BP DUP，205CC

Knies 等人对一名 12 岁德国女孩（患者 1143）进行了研究，该女孩的父母无关，患有范可尼贫血补充 W 组（FANCW；617784）（2017）鉴定出 RFWD3 基因中的复合杂合突变：2 bp 重复（c.205_206dupCC, NM_018124.3），导致 N 末端区域发生移码和提前终止（Leu69ProfsTer12），以及 c.1916T-颠换，导致 WD40 结构域中高度保守的残基处发生 ile639 到 lys（I639K；614151.0002）的取代，该残基负责 RPA2（179836）结合。千人基因组计划或 ExAC 数据库中均未发现这两种突变。由于在患者细胞中未检测到截短的蛋白质，预计 c.205_206dupCC 突变会导致无义介导的 mRNA 衰减和功能无效等位基因。暴露于丝裂霉素 C（MMC）和其他破坏剂后，患者细胞显示出更多的染色体断裂，并且这些缺陷可以通过野生型 RFWD3 的表达来恢复。具体结果表明 BRCA2（600185）依赖性同源重组（HR）存在缺陷。 I639K 变体的体外研究表明，与野生型相比，它对细胞核和染色质的重定位较少，并且与 RPA2 的相互作用受损，导致转导细胞中的 HR 受损。

.0002 FANCONI 贫血，补充组 W（1 名患者）
RFWD3、ILE639LYS

讨论 RFWD3 基因中的 c.1916T-A 颠换（c.1916T-A，NM_018124.3），导致 ile639 到 lys（I639K）取代，这种情况在患有以下疾病的患者中以复合杂合状态发现： Knies 等人的范可尼贫血补充 W 组（FANCW；617784）（2017），参见 614151.0001。