Anoctamin 1，钙激活氯化物通道; ANO1

跨膜蛋白 16A；TMEM16A

HGNC 批准的基因符号：ANO1

细胞遗传学位置：11q13.3 基因组坐标（GRCh38）：11:69,965,997-70,189,530（来自 NCBI）

▼ 描述

ANO1 属于含有 8 个跨膜片段的膜蛋白家族。ANO1 的表达与钙激活的氯离子通道活性相关（Ferrera 等人的总结，2009）。

▼ 克隆与表达

通过对在各种肿瘤类型中频繁扩增的染色体 11q13 区域内的数据库分析，Katoh 和 Katoh（2003）鉴定了源自先前未表征的 cDNA 克隆 FLJ10261 的 5 引物截短的部分 cDNA 序列。Katoh 和 Katoh（2003）使用计算机方法确定了基因 TMEM16A 的完整编码序列，该基因编码推导的 986 个氨基酸的蛋白质。选择性剪接产生较短的 TMEM16A 同工型。人类和小鼠 TMEM16A 蛋白具有 89.9% 的序列同一性；两者都有 8 个潜在的跨膜区域，N 端和 C 端尾部面向细胞质、5 个潜在的 N 连接糖基化位点和一个酪氨酸磷酸化位点。TMEM16A 与 C12ORF3（TMEM16B; 610109）、C11ORF25（TMEM16C; 610110）具有 58.4%、38.3% 和 38.6% 的氨基酸序列同一性，和 FLJ34272（TMEM16D；610111）。Katoh 和 Katoh（2003）认为这些蛋白质形成具有细胞质 N 末端和 C 末端尾部的 8 次跨膜蛋白质家族。计算机分析表明，TMEM16A mRNA 在头颈肿瘤、甲状旁腺肿瘤和卵巢肿瘤以及乳腺癌、胰腺癌、胃癌和子宫癌中表达。

通过数据库分析，Caputo 等人（2008）获得了TMEM16A的3个剪接变体，他们通过人支气管上皮细胞mRNA的RT-PCR获得了第四个变体。这 4 种变体编码的异构体的不同之处在于是否存在 4 个氨基酸片段（称为片段 a、b、c 和 d）。预计所有亚型都维持具有胞质 N 和 C 末端的 8 个跨膜螺旋的基本结构。氨基酸片段 a、b、c 和 d 也定位于胞质侧。全长 TMEM16A 蛋白因具有全部 4 个片段而命名为 TMEM16A（abcd），包含 1,008 个氨基酸。TMEM16A（abc）由从支气管上皮细胞分离的变体编码，含有982个氨基酸。计算机分析显示，TMEM16A 在外分泌腺和富含腺体的器官中优先表达。在小鼠中，Tmem16a 在乳腺、前列腺、大肠、肺、气管、子宫和犁鼻器中表达。免疫荧光分析显示转染HEK293细胞质膜上表达表位标记的TMEM16A（abc）。

通过生物信息学分析，Ferrera 等人（2009）发现TMEM16A外显子6b、13和15分别编码氨基酸片段b（22个氨基酸）、c（4个氨基酸）和d（26个氨基酸）。片段 a 的跳过是由于使用替代启动子造成的。对人体组织的 RT-PCR 分析揭示了外显子 6b、13 和 15 的组织特异性选择性剪接。外显子 6b 包含在肝脏和甲状腺中的几乎所有转录本中，胎盘、前列腺和气管中约 70% 的转录本中包含外显子 6b，而在所有其他检查组织中含量较低。外显子 13 包含在除大脑和骨骼肌之外的所有检查组织的所有转录本中，在脑和骨骼肌中，外显子 13 分别包含在 75% 和 90% 的转录本中。外显子 15 包含在脂肪组织、脑、子宫颈、结肠、心脏、肾、肺、卵巢、和小肠，除肝脏和胎盘外，所有其他检查组织中的含量均较低，因为肝脏和胎盘不存在这种物质。外显子 6b 含量高的组织倾向于排除外显子 15，反之亦然，这表明外显子 6b 和 15 的选择性剪接是协调的。

Rock 等人使用原位杂交（2008）发现 Tmem16a 在胚胎第 10.5 天（E10.5）发育小鼠的整个前肠上皮和初级肺芽中表达。Tmem16a 表达在近端气道上皮中持续存在，但在外周上皮远端（E11.5 和 E12.5）中不表达。此外，在气管背侧的间质中检测到强烈的染色，该间质产生气管肌。荧光标记的 Tmem16a 定位于小鼠肺癌细胞的质膜。

通过 PCR，Dutta 等人（2011）发现 TMEM16A 在人胆管上皮细胞系中表达。大鼠和小鼠全肝切片的免疫组织化学分析显示，在肝细胞中表达较弱，在大胆管细胞和小胆管细胞中表达强，并在顶膜处富集。

▼ 基因结构

Katoh和Katoh（2003）确定TMEM16A基因包含26个外显子，跨度约111 kb。存在两种剪接变体，一种具有外显子 15，一种不具有外显子 15。 Ferrera 等人（2009）鉴定了一个额外的外显子，即外显子 6b，并发现外显子 6b、13 和 15 是交替剪接的。

▼ 测绘

通过序列分析，Katoh 和 Katoh（2003）将人类 TMEM16A 基因定位到 FGF3（164950）和 FADD（602457）基因之间的染色体 11q13，并将小鼠 Tmem16a 基因定位到 7 号染色体上的同线性同源区域。

▼ 生化特征

晶体结构

保利诺等人（2017）以高分辨率描述了存在和不存在 Ca（2+）的情况下小鼠 Tmem16a 的结构。这些结构揭示了钙激活氯离子通道的配体结合状态和无配体状态之间的差异，并且与功能实验相结合表明了门控机制。在激活过程中，Ca（2+）与位于孔附近跨膜域内的位点结合，改变离子传导路径的静电特性，并触发与结合配体物理接触的 α 螺旋构象重排，从而直接耦合配体结合和孔开放。

冷冻电子显微镜

党等人（2017）展示了通过单粒子电子冷冻显微镜测定的小鼠 Tmem16a 在纳米盘和月桂基麦芽糖新戊二醇中跨膜结构域的从头原子结构。这些结构揭示了离子渗透孔并代表了不同的功能状态。月桂基麦芽糖新戊二醇的结构有 1 个 Ca（2+）离子解析在每个具有收缩孔的单体内；这可能对应于关闭状态。纳米圆盘的结构每个单体有2个Ca（2+）离子，其孔道呈封闭构象；这可能反映了通道衰弱，即 1 毫摩尔 Ca（2+）中钙激活氯离子通道长时间激活后通道活性逐渐丧失。

▼ 基因功能

用白细胞介素 4（IL4；147780）处理支气管上皮细胞会导致钙依赖性氯离子通道活性增加，这可能是通过调节相应基因的表达来实现的。由于这种效应可能是由相应通道基因的 mRNA 水平增加引起的，Caputo 等人（2008）进行了全局基因表达分析，以确定受 IL4 调节的膜蛋白。用针对这些蛋白质中的每一种的特异性小干扰RNA转染人胰腺和支气管上皮细胞表明，TMEM16A与钙依赖性氯电流相关，通过卤化物敏感荧光蛋白、短路电流和膜片钳技术进行测量。Caputo 等人使用转染的 Fischer 大鼠甲状腺（FRT）细胞进行短路电流实验，并使用 HEK293 细胞进行全细胞膜片钳实验（2008）表明 TMEM16A（abcd）和 TMEM16A（abc）亚型支持具有钙激活氯离子通道特征的膜电流。TMEM16A（0）缺乏全长TMEM16A（abcd）中的全部4个氨基酸片段，显示出较弱的电流活性。TMEM16A（abcd）的突变分析揭示了保守残基 lys636、arg563、arg912 和 gln757 在 TMEM16A 通道功能中的不同且关键的作用。卡普托等人（2008）得出结论，TMEM16A 是钙依赖性氯离子通道的内在成分（2008）表明 TMEM16A（abcd）和 TMEM16A（abc）亚型支持具有钙激活氯离子通道特征的膜电流。TMEM16A（0）缺乏全长TMEM16A（abcd）中的全部4个氨基酸片段，显示出较弱的电流活性。TMEM16A（abcd）的突变分析揭示了保守残基 lys636、arg563、arg912 和 gln757 在 TMEM16A 通道功能中的不同且关键的作用。卡普托等人（2008）得出结论，TMEM16A 是钙依赖性氯离子通道的内在成分（2008）表明 TMEM16A（abcd）和 TMEM16A（abc）亚型支持具有钙激活氯离子通道特征的膜电流。TMEM16A（0）缺乏全长TMEM16A（abcd）中的全部4个氨基酸片段，显示出较弱的电流活性。TMEM16A（abcd）的突变分析揭示了保守残基 lys636、arg563、arg912 和 gln757 在 TMEM16A 通道功能中的不同且关键的作用。卡普托等人（2008）得出结论，TMEM16A 是钙依赖性氯离子通道的内在成分。TMEM16A通道功能中的gln757。卡普托等人（2008）得出结论，TMEM16A 是钙依赖性氯离子通道的内在成分。TMEM16A通道功能中的gln757。卡普托等人（2008）得出结论，TMEM16A 是钙依赖性氯离子通道的内在成分。

杨等人（2008）表明，小鼠 Tmem16a（因其阴离子通道特性和 8 个跨膜结构域而被称为 anoctamin-1（Ano1））是一种真正的钙激活氯离子通道，可通过细胞内钙和钙动员刺激激活。Ano1 具有 8 个假定的跨膜结构域，并且与之前表征的通道没有明显的相似性，因此定义了一个新的离子通道家族。Ano1 的生物物理特性和药理学特征与天然钙激活氯化物电流完全一致。Ano1 在各种分泌上皮、视网膜和感觉神经元中表达。此外，小鼠 Ano1 的敲低显着降低了小鼠的天然钙激活氯电流以及唾液产生。杨等人。

Ferrera 等人通过在 HEK293 或 FRT 细胞中表达 TMEM16A 剪接变体（2009）表明TMEM16A（abc）和TMEM16A（abcd）产生相似的Cl-电流。TMEM16A（ac）中b段的缺失改变了Cl-电流的Ca（2+）敏感性，导致与TMEM16A（abc）和TMEM16A（abcd）相比，Cl-电流需要较低的Ca（2+）浓度来激活。TMEM16A（ab）中 c 段的缺失降低了 Ca（2+）激活的 Cl- 通道在正膜电位下的特征性时间依赖性激活。

Dutta 等人通过膜片钳记录人类胆管细胞系和啮齿动物胆管细胞（2011）表明 TMEM16A 作为钙激活氯离子通道发挥作用，具有时间依赖性激活和向外整流功能。将细胞暴露于 ATP 或 UTP 会产生类似的通道特性。通过小干扰 RNA 敲低 TMEM16A 表达可消除 ATP、UTP 和钙刺激电流。促炎细胞因子 IL4（147780）上调 TMEM16A 表达。杜塔等人（2011）得出结论，TMEM16A是参与肝胆耦合的嘌呤信号通路的一个组成部分，通过该通路，肝细胞释放到胆汁中的ATP可以刺激胆管细胞顶膜上的P2受体（见601167），增加氯离子转运，导致胆汁稀释。

通过过度表达和敲低分析，Ousingsawat 等人（2011）表明 TMEM16A 在人气道上皮细胞中形成 Ca（2+）激活的 Cl- 通道（CaCC），并且 TMEM16A 被 CFTR 抑制（602421）。然而，HEK293 细胞中的敲低分析表明，CFTR 电流很大程度上孤立于其他 TMEM16 亚型。CFTR 和 TMEM16A 呈反比关系，因为 HEK293 细胞中 TMEM16A 的额外表达会减弱 CFTR 电流。CFTR 和 TMEM16A 位于膜上，并且似乎存在物理相互作用。

贝内代托等人（2017）发现 Ca（2+）激活和 cAMP 刺激的 Cftr 依赖性氯离子分泌取决于 Tmem16a 的表达，因为 Tmem16a 的敲除消除了小鼠肠上皮细胞和小鼠呼吸道上皮细胞中的 Cftr 电流。对人气道上皮细胞的分析进一步证实，CFTR 和 TMEM16A 产生的 Cl-电流在功能上相互关联且相互依赖。从机制上讲，TMEM16A 增强 Ca（2+）储存释放，通过 Ca（2+）依赖性腺苷酸环化酶在 cAMP 存在的情况下为 CFTR 的激活提供 Ca（2+）。TMEM16A 还调节 CFTR 的膜表达。进一步的分析表明，CFTR 和 TMEM16A 可能在衔接蛋白的帮助下相互作用。

▼ 分子遗传学

Park 等人发现，库尔德-叙利亚近亲父母所生的一对姐妹和兄弟患有肠道运动障碍综合征（IDMTS; 620045），其中 1 名同胞的特征与非典型坏死性小肠结肠炎一致（2021）鉴定出 ANO1 基因（610108.0001）中 4 bp 缺失的纯合性。父母和未受影响的姐妹都是杂合子携带者。这些同胞中观察到的表现与 Ano1 基因敲除小鼠中观察到的表型相似，表现为肠道运动障碍、腹部膨胀和发育不良。通过免疫染色，作者在野生型和杂合鼻上皮细胞的顶膜中发现了 TMEM16A，但在受影响兄弟的鼻上皮细胞中却没有发现 TMEM16A。CFTR（602421）位于野生型细胞的顶膜中，但在杂合子携带者和纯合子中部分定位于细胞内和亚顶端。RT-PCR 显示杂合子携带者的基因表达减少，而纯合子患者中没有表达，这与蛋白质印迹分析中条带减少（杂合子）或缺失（纯合子）的结果一致。对鼻上皮细胞中 TMEM16A 氯电流的电生理学研究表明，杂合子细胞中的离子通道功能受损，钙激活离子电流减少，而纯合子细胞中没有电流。由于之前的研究表明 TMEM16A 功能和 CFTR 之间存在密切的相互依赖性，因此检查了 ANO1 变体对 CFTR 电流的影响；CFTR电流在野生型细胞中很容易被激活，与野生型相比，在杂合细胞中被激活的程度较小，

▼ 动物模型

洛克等人（2008）发现 Tmem16a -/- 小鼠以预期的孟德尔频率出生，但 90% 的小鼠在产后 9 天内死亡，并且没有存活超过 30 天的。部分 Tmem16a -/- 幼崽在出生后第一周内出现严重膨胀的腹部，食道、胃和肠道中存在不同量的空气，通常与紫绀外观相关。Tmem16a -/- 小鼠表现出严重的气管软化，气管软骨环沿整个气管长度存在间隙，气管上皮内陷区域缺乏纤毛细胞，气管上皮无法分层，上皮细胞核异常靠近基底膜，气管肌发育异常。由于软骨间充质不表达 Tmem16a，Rock 等人。

▼ 等位基因变异体（1 个选定示例）：

.0001 肠动力障碍综合征（1 个家庭）
ANO1、4-BP DEL、897+3AAGT 库尔德
-叙利亚血统的近亲父母所生的兄弟姐妹患有肠动力障碍综合征（IDMTS；620045），其中包括 1 名具有与非典型特征一致的同胞坏死性小肠结肠炎，Park 等人（2021）鉴定了 ANO1 基因中 4 bp 缺失（c.897+3_897+6delAAGT, NM_018043.5）的纯合性。该删除导致至少部分内含子 8 的保留、移码和提前终止密码子（Leu300ValfsTer58）。父母和未受影响的姐妹都是杂合子携带者。