身材矮小、小头畸形和内分泌功能障碍; X 射线修复交叉补充 4

真核生物使用至少 2 种途径来修复 DNA 双链断裂：同源重组和非同源末端连接（NHEJ）。核心 NHEJ 机制包括 XRCC4、DNA 连接酶 IV（LIG4; 601837 ） 和 DNA 依赖性蛋白激酶复合物，它由 DNA 末端结合 Ku70（G22P1; 152690 ）/Ku80（XRCC5; 194364 ） 异二聚体和催化亚基 PRKDC（ 600899 ）（ Mari et al., 2006 ）。

▼ 克隆与表达

XR-1是一种中国仓鼠卵巢细胞突变体，在细胞周期的G1部分对伽马射线杀伤异常敏感，但在S期后期对伽马射线损伤的抵抗力几乎正常。这种细胞周期敏感性与突变体无法修复由电离辐射（IR） 和限制性内切酶产生的 DNA 双链断裂有关。贾西亚等人（1990）在 5 号染色体上发现了一个人类基因，该基因通过生化方式将仓鼠缺陷恢复到野生型水平的伽马射线和博莱霉素抗性，并恢复其修复 DNA 双链断裂的能力。他们将基因命名为 XRCC4。

▼ 测绘

在研究 XR-1 和人类成纤维细胞之间形成的体细胞杂交体时，Giaccia 等人（1990）通过染色体分离分析将人类互补基因 XRCC4 对应到染色体 5。Otevrel 和 Stamato（1995）XRCC4 基因定位于 5q13-q14，该研究基于一种抗 γ 射线的人类：XR-1 仓鼠杂交细胞系，该细胞系含有人类 5 号染色体片段，该细胞与对 γ 射线敏感的 XR-1 突变细胞融合。用氨基糖苷 G418 选择后，总共 76 个杂种中的 2 个保留了野生型伽马射线抗性。使用来自 2 个抗性杂种的 DNA 作为探针对正常人淋巴细胞进行荧光原位杂交分析，在 5q13-q14 产生了一个共同的杂交区域。该基因在物理上位于 D5S427 和 D5S401 微卫星标记之间，并且使用含有人类染色体 5 中已知缺失的仓鼠/人类杂种来确认细胞学分配。

▼ 基因功能

李等人（1995）证明人类 XRCC4 基因恢复 DNA 双链断裂修复和支持 XR-1 CHO 细胞系中瞬时引入的底物的 V（D）J 重组的能力。他们表明相应的基因在 XR-1 细胞中被删除。XRCC4 编码一种普遍表达的产物。

Mari 等人使用人类和仓鼠细胞（2006）表明 DNA 末端的 Ku 异二聚体与溶液中的 Ku70/Ku80 处于动态平衡，表明 NHEJ 复合物的形成是可逆的。XRCC4 在 DNA 双链断裂上的积累取决于 Ku70/Ku80 的存在，而不是 PRKDC。马里等人（2006）发现 XRCC4 直接与 Ku70 相互作用，他们假设 XRCC4 作为 Ku70/Ku80 和 LIG4 之间的柔性系绳。

严等人（2007）通过检测 Xrcc4 或 Lig4（ 601837 ） 缺陷小鼠 B 细胞中的 CSR 来评估经典 NHEJ 途径是否对类别转换重组（CSR） 至关重要。经典 NHEJ 确实催化了 CSR 连接，因为经典 NHEJ 缺陷 B 细胞降低了 CSR 和大量 IgH 基因座（ 147100 ） 染色体断裂。然而，另一种明显偏向于微同源连接的末端连接途径，在经典的 NHEJ 缺陷 B 细胞中以出乎意料的稳健水平支持 CSR。在没有经典 NHEJ 的情况下，这种替代末端连接途径也经常将 IgH 基因座断裂连接到其他染色体以产生易位。

Guirouilh-Barbat 等人（2007）研究了 Xrcc4 和 Ku80 无效 XR-1 CHO 细胞中的 NHEJ，并显示了这些突变的影响存在差异。虽然由于使用了远离双链断裂的微同源性，在 Xrcc4-null 细胞中存在显着的末端连接，但 NHEJ 的效率降低了。相比之下，Ku80的敲除对端接效率几乎没有影响。然而，在两种突变细胞系中，末端连接的准确性都降低了。Guirouilh-Barbat 等人（2007）得出结论，KU80/XRCC4 途径是保守的，可以以有限的诱变为代价容纳非完全互补的末端。

Brouwer 等人使用双阱和四阱光镊与荧光显微镜相结合（2016）展示了人类 XRCC4、XLF（ 611290 ） 和 XRCC4-XLF 复合物如何与 DNA 实时相互作用。布劳威尔等人（2016）发现 XLF 刺激 XRCC4 与 DNA 的结合，形成沿 DNA 迅速扩散的异聚复合物。此外，作者发现 XRCC4-XLF 复合物牢固地桥接了 2 个孤立的 DNA 分子，并且这些桥能够沿着 DNA 滑动。这些观察结果表明，XRCC4-XLF 复合物在 DNA 周围形成可移动的套筒状结构，可以非常迅速地重新连接断裂的末端并将它们固定在一起。布劳威尔等人（2016）得出的结论是，了解这种机制的动力学和调控将有助于阐明 NHEJ 蛋白如何参与产生染色体易位。

▼ 分子遗传学

Shaheen 等人研究了一名身材矮小和小头畸形的 4 岁沙特阿拉伯女孩（SSMED; 616541 ）（2014）确定了 XRCC4 基因（W43R; 194363.0001 ） 中错义突变的纯合性。

默里等人（2015 年）分析了 208 名诊断为小头型原始侏儒症患者的外显子组测序数据，并确定了一名身材矮小、小头畸形和淋巴细胞减少的沙特阿拉伯男孩的 XRCC4 W43R 突变纯合性。该队列中 XRCC4 基因的重新测序确定了来自 4 个家族（ 194363.0002 - 194363.0006 ） 的另外 5 名患者的复合杂合性截断突变。所有突变在各自的家族中都与疾病分离。

在 50 岁的意大利双胞胎兄弟中，身材矮小、认知障碍、高促性腺激素性性腺机能减退、共济失调和扩张型心肌病，Bee 等人（2015）进行了全外显子组测序，并确定了先前报道的 XRCC4 基因（ 194363.0005 ） 中 R225X 突变的纯合性。

de Bruin 等人对来自智利农村的一对身材矮小、小头畸形、高促性腺激素性性腺功能减退症和早发性代谢综合征的兄弟姐妹进行了研究（2015）确定了与家族疾病分离 的 XRCC4 基因（D82E; 194363.0007 ）错义突变的纯合性。

在 3 名身材矮小、小头畸形和轻度发育迟缓的土耳其兄弟中，Rosin 等人（2015）确定了 XRCC4（R161Q; 194363.0008 ） 中错义突变的纯合性，该突变被发现会导致剪接缺陷。在一个同样受影响的瑞士女孩中，他们确定了 2 个先前报道的 XRCC4 突变、1-bp 缺失（c.25delC；194363.0002）和无义突变（R275X；194363.0003）的复合杂合性。

在一名身材矮小、小头畸形、甲状腺功能减退、糖尿病和进行性共济失调的女性中，Guo 等人（2015）确定了 XRCC4 中 R225X 突变（ 194363.0005 ） 和 1-bp 缺失（c.760delG; 194363.0009 ） 的复合杂合性。对患者细胞的功能分析表明，双链断裂修复存在明显缺陷，但 V（D）J 重组有效。郭等人（2015）得出结论，这代表了一种分离的影响表型，其中辐射诱导的双链断裂修复的显着缺陷可以与有缺陷的 V（D）J 重组分离。

▼ 动物模型

为了表征 XRCC4 的体内作用，Gao 等人（1998）通过基因靶向突变灭活小鼠的 XRCC4 基因。他们表明，原代鼠细胞中的 XRCC4 缺乏会导致生长缺陷、过早衰老、IR 敏感性和无法支持 V（D）J 重组。在小鼠中，XRCC4 缺乏会导致晚期胚胎致死，并伴有淋巴发生缺陷和神经发生缺陷，表现为新产生的有丝分裂后神经元细胞的广泛凋亡死亡。他们还在缺乏XRCC4 相关蛋白DNA 连接酶 IV（ 601837 ）的胚胎中发现了类似的神经元发育缺陷。这些发现表明，分化淋巴细胞和神经元严格需要 XRCC4 和 DNA 连接酶 IV 末端连接蛋白。

高等人（2000）培育 p53（ 191170 ） 缺陷纯合子与 XRCC4 缺陷杂合子产生双纯合子小鼠。p53 缺陷挽救了 XRCC4 缺陷表型的几个方面，包括胚胎致死率、神经元凋亡和细胞增殖受损。然而，V（D）J 重组或淋巴细胞发育受损并没有显着挽救。尽管 p53 缺陷使 XRCC4 缺陷小鼠在出生后存活，但它们通常死于前 B 细胞淋巴瘤，该淋巴瘤具有连接扩增的 c-myc 癌基因（ 190080 ） 和 IgH 基因座（见147100 ） 的染色体易位） 序列。此外，即使是缺乏 XRCC4 的胚胎成纤维细胞也表现出明显的基因组不稳定性，包括染色体易位。高等人（2000）得出结论，他们的发现支持非同源末端连接途径作为哺乳动物基因组的看护者的关键作用，这是正常发育和抑制肿瘤所必需的作用。XRCC4 -/- p53 -/- 小鼠的肿瘤易感性表型与 p53 -/- 小鼠的肿瘤易感性表型形成对比，后者在生命后期发展为缺乏易位的前 T 细胞淋巴瘤。

王等人（2008）发现在 p53 缺陷型外周小鼠 B 细胞中条件性删除 Xrcc4 会导致表面 Ig 阴性 B 细胞淋巴瘤。这些淋巴瘤通常具有将 IgH 与 Myc 融合的相互染色体易位，以及涉及 IgK 或 IgL 的大染色体缺失或易位，后者将 IgL 与癌基因或 IgH 融合。王等人（2008）得出结论，XRCC4 和 p53 缺陷型 pro-B 淋巴瘤通常通过基因扩增激活 MYC，而 XRCC4 和 p53 缺陷型外周 B 细胞淋巴瘤通常异位激活 MYC 的单个拷贝。

▼ 等位基因变体（ 9个精选示例）：

.0001 身材矮小、小头症和内分泌功能障碍
XRCC4、TRP43ARG
Shaheen 等人对一名患有严重身材矮小和小头畸形（SSMED; 616541 ）的 4 岁沙特阿拉伯女孩进行了研究（2014 年）确定了 XRCC4 基因中 c.127T-C 转换（c.127T-C，NM_003401.3）的纯合性，导致高度保守残基处的 trp43 到 arg（W43R）取代。XRCC4 缺陷成纤维细胞的功能分析表明电离辐射后 DNA 损伤修复的显着损害。

在一个身材矮小、极度小头畸形和淋巴细胞减少的沙特阿拉伯男孩中，Murray 等人（2015）确定了 W43R 突变的纯合性，位于 XRCC4 基因的头部结构域内。据报道，该突变与家族中的疾病分离，在控制人群中的等位基因频率为 3.3 x 10（-5），在 ExAC 数据库中未检测到纯合子。重组 XRCC4 在大肠杆菌细胞中的表达和纯化表明，与野生型相比，W43R 取代大大降低了蛋白质的溶解度，并且 XRCC4 突变体更容易降解。圆二色光谱分析表明，虽然突变蛋白是折叠的，但它与野生型不同。然而，因为与野生型相比，体外结扎试验没有显示突变体的结扎效率有任何显着降低，Murray 等人（2015）得出的结论是，W43R 取代更可能影响蛋白质稳定性而不是直接影响 XRCC4 功能。患者成纤维细胞的免疫印迹显示 XRCC4 以及 XLF（NHEJ1; 611290 ） 和 LIG4（ 601837 ） 的水平显着降低，表明 XRCC4 的减少会影响整个复合物的稳定性。

在涉及各种 XRCC4 突变对双链断裂修复的影响的互补实验中，Guo 等人（2015）观察到 W43R 突变体在与 c.760delG 突变体（ 194363.0009 ）表达时几乎没有互补性。他们得出结论，W43R 突变会损害 XRCC4 功能。

.0002 身材矮小、小头症和内分泌功能障碍
XRCC4, 1-BP DEL, 25C
在来自 3 个身材矮小和小头畸形家庭的 4 名儿童中（SSMED; 616541 ），Murray 等人（2015 年）确定了 XRCC4 基因中 2 个突变的复合杂合性：1 bp 缺失（c.25delC，NM_022550.2），预计会导致提前终止密码子（His9ThrfsTer8）和另一个截断突变。两个意大利兄弟和一个 9 岁的法国男孩在第二个等位基因上有一个 c.823C-T 过渡，导致 arg275 到 ter（R275X; 194363.0003 ） 替换，而一个 21 个月大的男孩来自英国有一个 c.-10-1G-T 颠换涉及第二个等位基因上外显子 2（ 194363.0004 ） 中的剪接受体。来自英国患者的成纤维细胞的免疫印迹显示 XRCC4 和 LIG4 显着减少（601837 ） 水平。

在一名身材矮小和小头畸形的 14 岁瑞士女孩中，Rosin 等人（2015）确定了 XRCC4 基因中 c.25delC 和 R275X 突变的复合杂合性。她的父母都是其中一个突变的杂合子。

.0003 身材矮小、小头症和内分泌功能障碍
XRCC4、ARG275TER
讨论 XRCC4 基因中的 c.823C-T 转换（c.823C-T，NM_022550.2），导致 arg275-to-ter（R275X） 取代，在 SSMED 患者的复合杂合状态中发现（ 616541 ） 由Murray 等人撰写（2015）和松香等人（2015），见194363.0002。

.0004 身材矮小、小头症和内分泌功能障碍
XRCC4、IVS1AS、GT、-1
讨论 XRCC4 基因外显子 2 中的 c.-10-1G-T 颠换（c.-10-1G-T，NM_022550.2），该基因在一名 21 个月大的男孩中以复合杂合状态发现Murray 等人的英国身材矮小和小头畸形（SSMD; 616541 ）（2015），见194363.0002。

.0005 身材矮小、小头症和内分泌功能障碍
XRCC4、ARG225TER
在一名身材矮小和小头畸形的 4 岁摩洛哥男孩（SSMED; 616541 ） 中，Murray 等人（2015）确定了 XRCC4 基因中 2 个无义突变的复合杂合性：c.673C-T 转换（c.673C-T，NM_022550.2），导致 C- 中的 arg225 到 ter（R225X） 取代末端结构域和 c.481C-T 转换，导致在卷曲螺旋结构域内 发生 arg161 到 ter（R161X; 194363.0006 ） 替换。

在 50 岁的意大利双胞胎兄弟中，第一代表亲所生，身材矮小、认知障碍、高促性腺激素性性腺机能减退、轴索感觉神经病和扩张型心肌病，Bee 等人（2015）确定了 XRCC4 基因中 R225X 突变的纯合性，预计会导致 C 末端蛋白质的三分之一丢失。他们未受影响的父亲和姐妹是 R225X 杂合子；他们的母亲无法获得 DNA。通过定量 PCR 对患者成纤维细胞的分析显示，与对照相比，XRCC4 转录水平显着降低；在从患者成纤维细胞获得的总裂解物中，通过蛋白质印迹分析无法检测到 XRCC4 蛋白，并且该结果得到了免疫荧光研究的支持。蜜蜂等人（2015）注意到 LIG4（601837 ） 明显存在于患者裂解物中，尽管显着降低（对照平均值的 40%）。伽马射线照射的突变细胞表现出双链断裂修复的减少，但没有消除。

在一名身材矮小、小头畸形、甲状腺功能减退、糖尿病、进行性共济失调和低级别丘脑胶质瘤的女性（患者 CSL16NG）中，最初被Neilan 等人报道为患者 3（2008），郭等人（2015）确定了 XRCC4 基因突变的复合杂合性：R225X 和 1-bp 缺失（c.760delG; 194363.0009），导致预计会导致过早终止密码子（Asp254fsTer68） 的移码。等位基因特异性定量 PCR 揭示了 R225X 等位基因的极低表达，与强烈的无义介导的 mRNA 衰变一致，而另一个等位基因显示大约 30% 的总 XRCC4 表达水平（而不是从 1 个等位基因完全表达时预期的 50% ）。患者成纤维细胞的免疫印迹显示未检测到 XRCC4，而免疫荧光显示在细胞质和细胞核中均可检测到低 XRCC4 信号；用对照成纤维细胞进行的稀释研究表明，患者细胞中 XRCC4 的正常水平不到 10%。免疫印迹还显示患者成纤维细胞中的 LIG4 显着降低，估计残留水平在正常值的 5% 至 15% 之间。与对照组相比，患者成纤维细胞具有明显的放射敏感性，双链断裂修复减少；野生型 XRCC4 挽救了辐照后合成 DNA 的能力和修复双链断裂的能力。质粒双链断裂重新连接测定表明，患者细胞中几乎不存在正常的直接末端连接，而是在连接处使用 6 bp 微同源性，这与有效非同源末端连接（NHEJ） 的丧失一致。与对照组相比，患者细胞中 V（D）J 重组的分析显示保真度增强；然而，还观察到免疫球蛋白类别转换重组模式的改变，这表明尽管患者的 IgA 水平正常，但重组过程存在缺陷，该重组过程依赖于经典的 NHEJ。HEK293 细胞中的共表达研究表明，c.760delG 突变体与 LIG4 形成复合物，表明 C 末端对于复合物的形成是可有可无的。在环己酰胺存在的情况下，c.760delG 突变体与野生型相比显着降解，并且通过添加蛋白酶体抑制剂抑制了降解。作者得出结论，c.760delG 突变的主要影响是蛋白酶体降解引起的蛋白质稳定性大大降低。

.0006 身材矮小、小头症和内分泌功能障碍
XRCC4、ARG161TER
讨论 XRCC4 基因中的 c.481C-T 转换（c.481C-T, NM_022550.02），导致 arg161 到 ter（R161X） 取代，在摩洛哥男孩的复合杂合状态下发现与Murray 等人的 SSMED（ 616541 ）合作（2015），见194363.0005。

.0007 身材矮小、小头症和内分泌功能障碍
XRCC4、ASP82GLU
de Bruin 等人对来自智利农村的一个患有身材矮小、小头畸形、高促性腺激素性性腺功能减退症、多结节性甲状腺肿和早发性代谢综合征（SSMED; 616541 ）的兄弟姐妹进行了研究（2015）鉴定了 XRCC4 基因外显子 3 中 c.246T-G 颠换的纯合性，导致 asp82 到 glu（D82E） 取代，预计会产生一个新的 5 素供体剪接位点，这将导致异常剪接和 in- 23 个氨基酸的帧丢失（Val83_Ser105del）。该突变与家庭中的疾病分离。患者 cDNA 的 RT-PCR 分析证实产生了大约 900-bp 的产物，但没有看到野生型 XRCC4 的大约 980-bp 产物。在患者成纤维细胞中进行的转染研究表明，与野生型成纤维细胞相比，正常的非同源末端连接 DNA 损伤修复过程严重受损，几乎完全使用了另一种微同源介导的末端连接过程。

.0008 身材矮小、小头症和内分泌功能障碍
XRCC4、ARG161GLN
在 3 名身材矮小、明显的小头畸形和轻度精神运动迟缓（SSMED; 616541 ） 的土耳其兄弟中，Rosin 等人（2015）鉴定了涉及 XRCC4 基因外显子 4 中最后一个核苷酸的 c.482G-A 转换（c.482G-A，NM_022406）的纯合性，导致 arg161 到 gln（R161Q）取代，但也预测会破坏内含子 4 的相邻供体剪接位点。他们的表亲父母是突变的杂合子，这在 1000 Genomes Project、Exome Variant Server 或 ExAC 数据库中没有发现。对所有家族成员的微卫星标记分析证实了所有受影响个体中 5 号染色体上 XRCC4 区域的纯合单倍型。通过对患者 cDNA 进行 RT-PCR，然后进行 Sanger 测序，观察到 3 个不同的转录本：一个由完全跳过外显子 4 产生的主要转录本，预计会导致移码和过早终止（Phe106IlefsTer1），由于完全跳过外显子 3 和 4 导致的次要转录本，也导致过早终止（Val47AspfsTer5），以及正确剪接的次要转录本携带 R161Q 错义突变。与对照相比，患者成纤维细胞的蛋白质印迹分析显示全长 XRCC4 蛋白严重减少，这与 RT-PCR 结果一致；然而，检测到一条微弱的野生型大小的 XRCC4 带，这被认为代表携带 R161Q 突变的全长 XRCC4。在患者成纤维细胞或转染的 HEK293 细胞中未观察到截短 XRCC4 蛋白的表达，这意味着蛋白质不稳定和截短变体的功能完全丧失。通过 MTT 法，与对照相比，患者成纤维细胞的蛋白质印迹分析显示全长 XRCC4 蛋白严重减少，这与 RT-PCR 结果一致；然而，检测到一条微弱的野生型大小的 XRCC4 带，这被认为代表携带 R161Q 突变的全长 XRCC4。在患者成纤维细胞或转染的 HEK293 细胞中未观察到截短 XRCC4 蛋白的表达，这意味着蛋白质不稳定和截短变体的功能完全丧失。通过 MTT 法，与对照相比，患者成纤维细胞的蛋白质印迹分析显示全长 XRCC4 蛋白严重减少，这与 RT-PCR 结果一致；然而，检测到一条微弱的野生型大小的 XRCC4 带，这被认为代表携带 R161Q 突变的全长 XRCC4。在患者成纤维细胞或转染的 HEK293 细胞中未观察到截短 XRCC4 蛋白的表达，这意味着蛋白质不稳定和截短变体的功能完全丧失。通过 MTT 法，在患者成纤维细胞或转染的 HEK293 细胞中未观察到截短 XRCC4 蛋白的表达，这意味着蛋白质不稳定和截短变体的功能完全丧失。通过 MTT 法，在患者成纤维细胞或转染的 HEK293 细胞中未观察到截短 XRCC4 蛋白的表达，这意味着蛋白质不稳定和截短变体的功能完全丧失。通过 MTT 法，松香等人（2015）观察到患者成纤维细胞的细胞毒性明显高于对照组，这表明 XRCC4 的功能损伤不仅直接影响双链断裂修复，而且如果 DNA 损伤仍未修复，还会导致细胞死亡。

.0009 身材矮小、小头症和内分泌功能障碍
XRCC4, 1-BP DEL, 760G
Guo 等人讨论了在一名患有 SSMED（ 616541 ）的女性中以复合杂合状态发现的 XRCC4 基因中的 c.760delG 突变（2015），见194363.0005。