延迟睡眠阶段障碍，易感; 光解酶 1

CRY1 及其昼夜节律表达模式是哺乳动物昼夜节律钟核心自动调节回路的核心。当与 BMAL1（ARNTL; 602550 ）/CLOCK（ 601851 ） 复合体结合时，CRY1 主要显示晚上时间的表达，并作为早上时间元素（E 框/E-prime 框）的强抑制因子（Ukai-Tadenuma 等人总结等人，2011 年）。

▼ 克隆与表达

光解酶是介导光活化的酶，光活化是一种修复机制，可消除紫外线引起的 DNA 损伤。大多数光解酶包含 2 个生色团：黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD） 和第二个可变生色团。与在高等真核生物中发现的 II 类光解酶相比，I 类光解酶包括微生物光解酶和几种植物蓝光光感受器。范德斯佩克等人（1996）鉴定了与细菌光解酶同源的 EST 克隆。他们克隆了编码 586 个氨基酸的多肽的全长 cDNA，该多肽与植物蓝光受体有 25% 的相同性。序列保守表明人光解酶1具有FAD结合能力。Northern印迹分析表明该基因是组成型表达的，这表明光解酶1可能具有修复紫外线损伤DNA以外的功能。

托多等人（1996）从人脑 cDNA 文库中分离出一个 cDNA，他们将其称为人（6-4） 光解酶同源蛋白。人类蛋白质的氨基酸序列与果蝇（6-4） 光解酶的氨基酸序列具有 48% 的同一性。3-kb mRNA 在多个组织中表达。

▼ 基因功能

许等人（1996）确定人类（6-4） 光解酶（CRY1） 蛋白与 CRY2（ 603732 ）具有 73% 的氨基酸同一性。许等人（1996）纯化了人类 CRY1 和 CRY2 蛋白，并将它们定性为含有 FAD 和蝶呤辅因子的麦芽糖结合融合蛋白。CRY1 和 CRY2 蛋白都缺乏光解酶活性。许等人（1996）得出结论，这些蛋白质不是光解酶，但可能在人体中充当蓝光光感受器。小林等人（1998）证明，虽然 Cry1 定位于线粒体，但 Cry2 主要存在于细胞核中。小鼠 Cry1 的 N 末端包含线粒体转运信号。Cry1 蛋白与 DNA Sepharose 紧密结合，而 Cry2 蛋白则没有。

格里芬等人（1999）在一项试验中检测了人类 CRY1 和 CRY2 的活性，其中由 CLOCK 和 BMAL1 组成的异二聚体激活剂在培养细胞中驱动来自小鼠 Per1 基因（ 602260 ） E 框的荧光素酶报告基因。当细胞从转染到收获时保持在完全黑暗中时，CRY1 和 CRY2 都强烈抑制 CLOCK-BMAL1 活性，CRY1 始终显示出比 CRY2 更有效的抑制作用。为了确定光是否可以调节 CRY 活动，Griffin 等人（1999）在保持在恒定黑暗或恒定光照下的成对细胞组中进行转录报告基因分析。没有观察到差异。使用酵母 2 杂交试验，其中酵母转化体在恒定光照或黑暗条件下一式两份地生长，CRY1 和 CRY2 显示出与哺乳动物时钟成分的特异性相互作用，而不受光的影响。人类 CRY1 与小鼠 Per1 和 BMAL1 产生强烈的相互作用信号，与小鼠 Per1 的相互作用信号适度但可重现，与 CLOCK 或 TIM 的背景没有相互作用信号（ 603887 ）。CRY2 与 CRY1 的相似之处在于它与小鼠 Per2 产生了强烈的交互信号（603426），但不同之处在于它与 CLOCK 和 TIM 产生了微弱但可重现的交互信号，而与小鼠 Per1 或 BMAL1 没有可检测到的交互信号。格里芬等人（1999）得出结论，这些结果强烈表明 CRY1 和 CRY2 通过与哺乳动物细胞中的 CLOCK-BMAL1 异二聚体形成直接接触来抑制它，可能在包括 PER 和 TIM 蛋白的多蛋白复合物中。Griffin 等人的额外实验（1999）表明 CRYs 和 TIM 之间存在特定的功能拮抗作用，并表明在生物钟反馈回路中抑制 CLOCK-BMAL1 活性的蛋白质之间存在交叉调节。格里芬等人（1999）建议果蝇 CRY 举例说明了光感受器作为昼夜节律反馈回路的光依赖性调节器的祖先作用，而哺乳动物 CRY 保留了昼夜节律反馈回路中的作用，但已经摆脱了它们的直接光感受器功能。

久米等人（1999）确定小鼠 Cry1 和 Cry2 基因在时钟反馈回路的负侧起作用。他们指出，小鼠 Cry1 和 Cry2 是核蛋白，它们与每个 Per 蛋白相互作用，将每个 Per 蛋白从细胞质转移到细胞核，并在视交叉上生物钟中有节奏地表达。萤光素酶报告基因检测表明，单独的 Cry1 或 Cry2 消除了 Clock/Bmal1 E 框介导的转录。小鼠 Per 和 Cry 蛋白似乎对转录复合物有不同的抑制作用。

为了研究 NPAS2（ 603347 ） 的生物学作用，Reick 等人（2001）制备了能够条件诱导 NPAS2:BMAL1 异二聚体的神经母细胞瘤细胞系，并通过代表性差异分析、DNA 微阵列和 Northern 印迹鉴定了推定的靶基因。NPAS2 和 BMAL1 的共诱导激活了内源性 Per1、Per2 和 Cry1 基因的转录，这些基因编码昼夜调节装置的负激活成分，并抑制了内源性 BMAL1 基因的转录。对保持 24 小时明暗循环的野生型小鼠额叶皮层的分析显示，Per1、Per2 和 Cry1 mRNA 水平在黑暗期间升高，在光照期间降低，而 BMAL1 mRNA 显示相反的模式。对保持在恒定黑暗中的小鼠进行的原位杂交分析表明，在 NPAS2 缺陷小鼠中，Per2 mRNA 丰度不会随昼夜节律周期而波动。因此，NPAS2 可能是哺乳动物前脑中分子钟的一部分。

埃切加雷等人（2003）证明小鼠肝脏中核心时钟机制的转录调节伴随着 H3 组蛋白（见602810）乙酰化的节律，并且 H3 乙酰化是 Cry 抑制作用的潜在目标。Per1、Per2 和 Cry1 基因的启动子区域在 H3 乙酰化和 RNA 聚合酶 II（见180660）结合中表现出昼夜节律，与相应的稳态 mRNA 节律同步。组蛋白乙酰转移酶 p300（ 602700 ） 在体内随时钟以时间依赖性方式沉淀。此外，Cry 蛋白抑制 p300 诱导的 Clock/Bmal1 介导的转录增加。埃切加雷等人（2003）得出结论，相对于 Per 节律，Cry1 mRNA 节律的延迟时间是由于 Rev-Erb-α（ 602408 ） 和 Clock/Bmal1 的协调活动，并定义了一种新的昼夜节律相位控制机制。

布萨等人（2004）表明，果蝇 CRY 与 TIM（ 603887 ） 的结合在果蝇中是光依赖性的，并且不可逆地将 TIM 用于蛋白酶体降解。相反，CRY 降解取决于连续的光照，表明 CRY-TIM 相互作用是短暂的。一个新的 CRY 突变表明 CRY 的光解酶同源结构域足以进行光检测和光转导，而羧基末端结构域调节 CRY 稳定性、CRY-TIM 相互作用和昼夜光敏性。

对调节生物钟的转录电路的系统级理解，Ueda 等人（2005）在进化保守的顺式元件的全面监测和转录动力学的测量中确定了 16 个时钟和时钟控制基因上的时钟控制元件。上田等人（2005）发现E框（CACGTG）和E-prime框（CACGTT）控制了Per1（602260）、Nr1d2（602304）、Per2（603426）、Nr1d1（602408）、Dbp（124097）、Bhlhb2（604256 ）的表达） 和 Bhlhb3（ 606200） 转录遵循阻遏物-先于-激活物模式，导致转录活性延迟。RevErbA/ROR（ 600825 ） 结合（RRE） 元件也通过阻遏物-先于-激活物模式调节 Arnt1、Npas2（ 603347 ）、Nfil3（ 605327 ）、Clock、Cry1 和 Rorc（ 602943 ） 的转录活性。DBP/E4BP4 结合元件通过抑制因子-反相-激活因子机制控制 Per1、Per2、Per3（ 603427 ）、Nr1d1、Nr1d2、Rora 和 Rorb（ 601972 ） 的表达，从而产生高幅度的转录活性。上田等人（2005）表明 E/E-prime 框的调节是哺乳动物生物钟的拓扑脆弱性，这一概念已使用体外表型分析系统在功能上得到验证。

桑德雷利等人（2007 年）发现 ls-tim 是果蝇Timeless突变等位基因，可增强滞育，减弱生物钟的光敏性并导致突变蛋白二聚化为隐花色素减少。

奥尼尔等人（2008 年）表明，cAMP 信号构成了昼夜节律振荡网络的另一个真正组成部分。他们提出，由转录振荡器驱动的 cAMP 信号的日常激活反过来会维持转录节律的进展。这样，时钟输出构成后续周期的输入。

研究小鼠成纤维细胞，Lamia 等人（2009）证明营养反应性单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK；参见602739 ） 磷酸化并破坏时钟成分 CRY1。在小鼠肝脏中，AMPK 活性和核定位是有节奏的，并且与 CRY1 核蛋白丰度呈负相关。AMPK 的刺激使隐花色素不稳定并改变了昼夜节律，而 AMPK 通路在基因上被破坏的小鼠表现出外周时钟的改变。因此，Lamia 等人（2009）得出结论，AMPK 的磷酸化使隐花色素能够将营养信号转导至哺乳动物外周器官的生物钟。

Ukai-Tadenuma 等人（2011）注意到 CRY1 在其调控区域包含一个 E 框和一个 E-prime 框，它们是早晨时间元素，在内含子 1 中包含 2 个 RRE 元素，它们是夜间元素。他们确定了功能性 D 框，它们是 CRY1 启动子区域中的白天元素。通过用一系列 Cry1 构建体转染 Cry1 -/- Cry2 -/- 细胞，Ukai-Tadenuma 等人（2011）表明 D 框和 RRE 的组合引起了晚上的 Cry1 表达，并且昼夜节律需要 Cry1 表达的显着延迟。

拉米亚等人（2011）表明 2 个昼夜节律共调节因子 Cry1 和 Cry2（ 603732 ） 与糖皮质激素受体（ 138040 ）相互作用） 以一种配体依赖的方式并在全球范围内改变小鼠胚胎成纤维细胞对糖皮质激素的转录反应：隐花色素缺乏会大大降低基因抑制，并使地塞米松诱导的基因数量增加大约一倍，这表明隐花色素广泛地反对糖皮质激素受体激活并促进抑制。在小鼠中，Cry1 和/或 2 的遗传缺失导致葡萄糖耐受不良和循环皮质酮的持续高水平，这表明下丘脑-垂体-肾上腺轴的抑制减少以及肝脏中糖皮质激素反式激活增加。在基因组上，隐花色素 1 和 2 与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 1（PCK1; 614168 ） 中的糖皮质激素反应元件相关联） 以激素依赖性方式启动子，地塞米松诱导的 Pck1 基因转录在隐花色素缺乏的肝脏中显着增加。拉米亚等人（2011）得出结论，他们的结果揭示了一种特定的机制，隐花色素通过该机制将时钟和受体靶基因的活性与支持正常代谢稳态的复杂基因组回路结合起来。

在哺乳动物中，PERIOD（PER1；602260和 PER2；603426）和 CRYPTOCHROME（CRY1 和 CRY2；603732）蛋白质积累，形成一个大的核复合体（PER complex），并抑制它们自身的转录。帕德马纳班等人（2012）发现小鼠 PER 复合物包括 RNA 解旋酶 DDX5（ 180630 ） 和 DHX9（ 603115 ）、活性 RNA 聚合酶 II 大亚基（ 180660 ）、Per and Cry pre-mRNAs 和 SETX（ 608465）），一种促进转录终止的解旋酶。在昼夜负反馈期间，RNA 聚合酶 II 在 Per 和 Cry 基因的终止位点附近积累，但在对照基因上没有积累。在 Per 和 Cry 终止位点向延伸聚合酶募集 PER 复合物抑制了 SETX 作用，阻碍了 RNA 聚合酶 II 的释放，从而抑制了转录重新启动。因此，生物钟负反馈包括对转录终止的直接控制。

▼ 测绘

范德斯佩克等人（1996）使用原位杂交将光解酶 1 基因定位到人类染色体 12q23-q24.1。他们指出，该区域包括尺侧乳腺综合征（ 181450 ） 和毛囊角化病（ 124200 ） 的部位。小林等人（1998）分离并鉴定了小鼠 Cry1 和 Cry2 基因，并将它们分别对应到染色体 10C 和 2E。

▼ 分子遗传学

Patke 等人在 7 个无关家庭的受影响成员中，主要是土耳其血统，患有延迟睡眠阶段障碍（DSPD; 614163 ）（2017）在 CRY1 基因（ 601933.0001 ） 中发现了一个剪接位点突变）。第一个家族的突变是通过候选基因和全外显子组测序的结合发现的。该变异在人类遗传变异数据库中的发现频率为 0.6%：1000 Genomes Project 中的次要等位基因频率为 0.0012，ExAC 数据库中为 0.004335；该频率在一般人群中 DSPD 患病率的报告范围内。体外功能表达研究表明，突变体 CRY1 通过功能获得增加了昼夜节律。与野生型相比，突变蛋白对细胞核的定位增加，并且与其靶转录因子 CLOCK 和 ARNTL 的相互作用增加，从而导致转录抑制增加。

▼ 动物模型

范德霍斯特等人（1999）破坏了小鼠的 Cry1 和 Cry2 基因。纯合 Cry1 -/-、Cry2 -/- 和双突变小鼠在暴露于 12 小时/12 小时光/暗周期时具有正常的 24 小时昼夜节律。在完全黑暗中，Cry1 -/- 小鼠的时钟运行速度比野生型小鼠快（22.51 +/- 0.06 小时，P = 0.00001），而 Cry2 -/- 小鼠的时钟速度较慢（24.63 +/- 0.06 小时，P = 0.00001）。在完全黑暗的环境中，双突变小鼠表现出惊人的瞬时心律失常，表明体内没有生物钟。“时钟”突变小鼠的不同之处在于，它表现出更渐进的心律失常发作。只有 1 个野生型 Cry2 拷贝的小鼠表现出自由奔跑的节律，甚至比 Cry1 敲除的小鼠还要短，逐渐发展为心律失常。一旦恢复到光/暗循环，就会恢复正常的 24 小时周期。范德霍斯特等人（1999）得出结论，他们的结果表明 Cry 蛋白参与维持周期长度和昼夜节律，并且 Cry1 和 Cry2 之间的关键平衡是正常时钟功能所必需的。

弗里德曼等人（1999）研究了缺乏视杆细胞和视锥细胞的小鼠的昼夜节律行为。这些老鼠保持了一种轻微的昼夜节律，它们随着去核而失去了这种节律。卢卡斯等人（1999）研究了缺乏视杆细胞和视锥细胞的小鼠松果体褪黑激素的分泌。响应于波长 509 nm 的单色光，松果体褪黑激素有正常的抑制作用。作者建议哺乳动物有额外的眼光感受器，它们用于调节时间生理，并建议 Cry1 和 Cry2 作为候选者。

冈村等人（1999）证明，在缺乏 Cry1 和 Cry2 的小鼠中，时钟基因 Per1 和 Per2 的循环表达在视交叉上核和外周组织中被消除，并且 Per1 和 Per2 mRNA 水平组成性高。这些发现表明，在没有 Cry1 和 Cry2 的情况下，生物钟被消除，并支持哺乳动物 CRY 蛋白在昼夜节律反馈回路的负肢中起作用的观点。Cry 双突变小鼠保留了由已知相移野生型动物生物钟的短暂光刺激诱导的 Per1 和 Per2 表达的能力。因此，Cry1 和 Cry2 对于生物钟的光诱导相移是可有可无的。

谢尔曼等人（2000）证明，在小鼠中，主生物钟的核心机制由相互作用的正负转录和翻译反馈回路组成。对时钟/时钟突变小鼠、纯合 Per2 突变体和 Cry 缺陷小鼠的分析显示 Bmal1 节律显着改变，这与 Per2 在 Bmal1 环的正调节中的主导作用一致。Cry 抑制Cry:Bmal1 介导的转录的体外分析表明，抑制是通过直接的蛋白质-蛋白质相互作用，孤立于Per 和Tim 蛋白。Per2 是 Bmal1 循环的正调节剂，Cry1 和 Cry2 是 Period 和 Cryptochrome 循环的负调节剂。

八木田等人（2001）使用来自 Cry 突变小鼠的野生型和 Cry1 -/- 和 Cry2 -/- 缺陷细胞系来证明培养的成纤维细胞中的外周振荡器与（1） 所有的时间表达谱中的视交叉上核中的振荡器相同。已知的时钟基因；（2）各种mRNA节律的相位（即Bmal1和Per的反相位振荡）；（3） 最大 mRNA 水平与核 Per1 和 Per2 蛋白出现之间的延迟；（4） 在没有功能性 Cry 基因的情况下无法产生振荡；（5） Cry蛋白对周期长度的控制。

携带突变 Per2 基因的小鼠在持续黑暗中逐渐失去昼夜节律。奥斯特等人（2002）将 Per2 PAS 蛋白相互作用结构域突变的小鼠与 Cry1 -/- 或 Cry2 -/- 小鼠杂交。双纯合突变动物以预期的孟德尔比率出生，看起来有生育能力，并且在形态上与野生型动物没有区别。Per2 突变体-Cry2 -/- 小鼠在持续黑暗中保持昼夜节律和正常时钟基因表达模式，这表明 Cry2 作为 Per2 的非等位基因抑制因子发挥作用。与此形成鲜明对比的是，Per2 突变体-Cry1 -/- 小鼠没有保持昼夜节律，而是在持续的黑暗中表现出完全的行为心律失常。

范格尔德等人（2003）测试了隐花色素突变小鼠（Cry1 -/-; Cry2 -/-）、外视网膜退化（rd/rd） 小鼠和所有这些基因座的突变小鼠以及同窝小鼠对照的瞳孔光反应。与对照小鼠相比，rd/rd 小鼠的收缩明显减少。隐花色素的双突变体显示出与对照小鼠相似的瞳孔反应。在 470 nm 光强度下，在三次敲除中几乎没有观察到瞳孔收缩。三重突变体的瞳孔反应对蓝光的敏感性约为 rd/rd 小鼠的 5%。在非常明亮的光线下，三重突变小鼠的一些瞳孔反应被保留，尽管瞳孔运动有些迟缓。在 Cry1 -/-;rd/rd 和 Cry2 -/-;rd/rd 小鼠中注意到瞳孔反应的 50% 收缩阈值，并且与 rd/rd 小鼠相当，表明 Cry1 或 Cry2 功能足以保留 rd/rd 动物的瞳孔反应。由于所有小鼠都具有相同的应变背景，应变差异不太可能解释观察到的瞳孔光反应差异。范格尔德等人（2003）提出鼠隐花色素可以作为视网膜内色素。

池田等人（2007）发现，当维持在明暗循环中时，Cry1 -/- Cry2 -/- 双突变小鼠表现出正常的昼夜节律运动活动，包括进食。然而，耗氧量、心率和体温的昼夜节律性被废除。由于胰岛素分泌减少，Cry1 -/- Cry2 -/- 小鼠也表现出葡萄糖耐量受损。

▼ 等位基因变体（ 1 示例）：

.0001 延迟睡眠阶段障碍，易感性
CRY1，IVS11DS，交流，+3（rs184039278）
Patke 等人在 7 个无关家庭的受影响成员中，主要是土耳其血统，患有延迟睡眠阶段障碍（DSPD; 614163 ）（2017）鉴定了 CRY1 基因的内含子 11 中的 A 到 C 颠换（c.1657 + 3A-C），导致剪接位点改变。对 1 名患者的细胞分析证实，该突变导致外显子 11 缺失，C 末端区域有 24 个残基在读框内缺失。第一个家族的突变是通过候选基因和全外显子组测序的结合发现的。该突变与所有家庭的疾病分离；杂合子携带者31名，纯合子携带者8名，杂合子和纯合子携带者之间无表型差异。该变异在人类遗传变异数据库中的发现频率为 0.6%：1000 Genomes Project 中的次要等位基因频率为 0.0012，ExAC 数据库中为 0.004335；该频率在一般人群中 DSPD 患病率的报告范围内。小鼠胚胎成纤维细胞的体外功能表达研究表明，与野生型相比，突变型 CRY1 使昼夜节律增加了约半小时，这与人类表型相似。与野生型相比，突变蛋白对细胞核的定位增加，并且与靶转录因子 CLOCK 的相互作用增加。601851 ） 和 ARNTL（ 602550 ），导致与功能获得一致的转录抑制增加。染色质免疫沉淀研究表明，CRY1 突变从染色质的靶基因启动子处置换了 CLOCK 和 ARNTL 转录因子，导致这些靶基因的表达降低。