凝胶剂

Gelsolin 是一种由白细胞、血小板和其他细胞组成的蛋白质，在亚微摩尔钙的存在下切断肌节蛋白丝，从而分离细胞质肌节蛋白凝胶。不依赖钙的机制逆转了这一过程。具有 23 个以上 N 末端氨基酸的凝溶胶蛋白变体是一种血浆成分，可能参与从循环中清除最丰富的人体蛋白质肌节蛋白。Kwiatkowski 等人（1986）分离了全长血浆凝溶胶蛋白 cDNA 克隆。Northern印迹分析表明单个基因编码细胞和血浆凝溶胶蛋白。这种蛋白质可能是独特的，因为它既可用于分泌，也可用于细胞质内定位。

▼ 测绘

通过体细胞杂交体的Southern印迹分析和原位染色体定位，Kwiatkowski 等人（1988）证明 GSN 基因位于 9q32-q34。与含有费城染色体的细胞进行原位杂交，以及慢性髓性白血病细胞 DNA 的 Southern 印迹分析表明，GSN 与位于 9q34的 ABL（ 189980 ） 着丝粒。此外，NotI 消化的脉冲场凝胶电泳分离 DNA 的 Southern 印迹分析表明 GSN 与 ABL 有 40 或更多 kb 着丝粒。皮尔兹等人（1992）使用种间回交将 Gsn 基因对应到小鼠 2 号染色体。

▼ 基因功能

莫里等人（1990）确定了凝溶胶蛋白与芬兰淀粉样变性的淀粉样蛋白之间的氨基酸同源性（ 105120 ）。Haltia 等人（1990）同样表明，这种疾病中的淀粉样蛋白在抗原性和结构上与凝溶胶蛋白相关。Gelsolin 也称为 brevin，或肌节蛋白解聚因子；它是主要的细胞内和细胞外肌节蛋白切断蛋白。Gelsolin 和 Gc 蛋白（GC; 139200 ） 共同构成了细胞外肌节蛋白清除系统（ Lee and Galbraith, 1992 ），它可以防止在细胞坏死情况下肌节蛋白释放到细胞外空间的毒性作用。

瓦斯康塞洛斯等人（1994）表明，囊性纤维化患者（ 219700 ） 的粘稠痰液中含有源自白细胞的丝状肌节蛋白，而切断肌节蛋白丝的凝溶胶蛋白可在体外迅速降低 CF 痰液样品的粘度。他们认为凝溶胶蛋白可能作为 CF 患者的粘液溶解剂具有治疗潜力。

半胱天冬酶 介导的蛋白水解是细胞凋亡过程的关键和核心要素。因此，确定半胱天冬酶的下游分子靶点很重要。镰田等人（1998）建立了一种通过酵母 2-杂交系统的 2 个主要修饰来克隆 半胱天冬酶 底物基因的方法：（1） 在 ADH1（ 103700 ） 下，具有活性 半胱天冬酶 的大亚基和小亚基均在酵母中表达。） 启动子和小亚基融合到 LexA DNA 结合域；（2） 引入点突变，用丝氨酸取代活性位点半胱氨酸，从而防止底物的蛋白水解切割，可能稳定酵母中的酶-底物复合物。在使用 半胱天冬酶-3 的诱饵质粒筛选小鼠胚胎 cDNA 表达文库后，Kamada 等人（1998）获得了 13 个编码与 半胱天冬酶-3 结合的蛋白质的克隆，并表明 10 个克隆，包括凝溶胶蛋白，一种与细胞凋亡有关的肌节蛋白调节蛋白，在体外被重组 半胱天冬酶-3 切割。使用相同的诱饵，他们还从人胸腺 cDNA 表达文库中分离出人凝溶胶蛋白 cDNA。他们表明人凝溶胶蛋白在 Fas 介导的体内细胞凋亡过程中被切割，并且人凝溶胶蛋白的 半胱天冬酶-3 切割位点位于 5 个氨基酸序列 DQTD（352）G 中的 asp352（D352） 处，发现与先前的观察结果一致在鼠凝溶胶蛋白上。此外，Kamada 等人（1998）将凝溶胶蛋白的抗凋亡活性归因于阻止导致细胞色素 c 从线粒体释放到细胞质中的步骤。结果证明了这种克隆方法对于鉴定半胱天冬酶和可能的其他其他酶的底物的有用性。

为了研究凝溶胶蛋白相关淀粉样变性的发病机制，Paunio 等人（1994）用含有编码血浆凝溶胶蛋白野生型（D187） 和突变型（N187 和 Y187） 的 cDNA 的表达载体衍生物转染哺乳动物间充质 COS-1 细胞。发现两种与疾病相关的凝溶胶蛋白突变形式都被异常加工，导致异常的 68-kD 凝溶胶蛋白片段分泌到培养基中。该片段可能代表蛋白质的羧基末端部分并包含建议的淀粉样蛋白形成序列。

在使用 RNA 干扰来识别参与纤毛发生控制的人类基因的功能基因组筛选中，Kim 等人（2010）确定了 2 个凝溶胶蛋白家族蛋白，GSN 和 AVIL（ 613397 ），它们通过切断肌节蛋白丝来调节细胞骨架肌节蛋白组织。2 个孤立的 siRNA 对 GSN 蛋白的消耗显着减少了纤毛细胞数量，表明肌节蛋白丝切断与纤毛发生有关。相比之下，肌节蛋白相关蛋白 ACTR3（604222） 的沉默是ARP2/3 复合物的主要成分，是肌节蛋白在细丝分支处成核所必需的，它导致纤毛长度显着增加，并且孤立于血清促进纤毛发生饥饿。金等人（2010）得出的结论是，他们的观察表明分支肌节蛋白网络形成在纤毛发生中具有抑制作用。

▼ 生化特征

芬兰淀粉样变性中残基 187 处的单核苷酸突变（D187N 137350.0001或 D187Y 137350.0002）发生在肌节蛋白调节蛋白凝溶胶蛋白的结构域 2 内。该突变以某种方式允许暴露被掩盖的切割位点，从而导致形成淀粉样蛋白片段的第一步。卡兹米尔斯基等人（2000）进行了核磁共振（NMR） 实验，研究野生型和 D187N 凝溶胶蛋白结构域 2 之间的结构和动态变化。根据他们的观察，Kazmirski 等人（2000）提出D187N突变使结构域2的C末端尾部不稳定，导致更多暴露的切割位点并导致形成淀粉样蛋白片段的第一个蛋白水解步骤。

卡兹米尔斯基等人（2002）确定了凝溶胶蛋白的结构域 2（D2，残基 151-266）的结构，发现 asp187 是二价镉离子金属结合位点的一部分。凝溶胶蛋白向其活性形式的构象转变需要两个二价钙离子。卡兹米尔斯基等人（2002）表明 D2 中的镉结合位点是这两个钙结合位点之一，对 D2 的稳定性至关重要。asp187 突变为 asn（ 127350.0001 ） 破坏了 D2 中的钙结合，导致钙激活时不稳定。不稳定性使该结构域成为异常蛋白水解的目标，从而启动了导致芬兰型家族性淀粉样变性的级联反应的第一步。

▼ 动物模型

为了研究凝溶胶蛋白的体内功能，Witke 等人（1995）产生了转基因凝溶胶蛋白缺失小鼠。尽管胚胎发育和寿命正常，但 Gsn 缺失小鼠的血小板形状变化减少，导致出血时间延长。中性粒细胞在体内迁移到腹膜渗出液和体外被延迟。真皮成纤维细胞有过多的肌节蛋白应力纤维，迁移速度比野生型成纤维细胞慢，但体外收缩性增加。观察结果确定了凝溶胶蛋白对参与应激反应的细胞类型的快速运动反应的要求，例如止血、炎症和伤口愈合。凝溶胶蛋白和其他具有相似肌节蛋白丝切断活性的蛋白质均未在早期胚胎细胞中表达，这表明这种肌节蛋白丝动力学机制对于早期胚胎发生过程中的运动不是必需的。

▼ 等位基因变体（ 2 示例）：

.0001 淀粉样变性，家族性，芬兰型
淀粉样变性，MERETOJA 型
GSN, ASP187ASN
芬兰型遗传性淀粉样变性（ 105120 ） 中的淀粉样蛋白是凝溶胶蛋白变体分子的肌节蛋白丝结合区的片段。Maury 等人使用 PCR 和基因组 DNA 的等位基因特异性寡核苷酸杂交分析（1990）确定了一个单碱基突变，654G-A。在研究的所有 5 名无关的芬兰淀粉样变性患者中都发现了这种核苷酸取代，但在 45 名无关的对照受试者中没有发现。他们通过证明这种疾病中的淀粉样蛋白具有 asp187 到 asn 突变（D187N）（Maury（ 1990 , 1991 ）） 来指导他们开发等位基因特异性寡核苷酸杂交方法，这是由 GAC 变为AAC。吉索等人（1990）和利维等人（1990）同样确定了 D187N 的变化。希尔图宁等人（1991 年）在芬兰南部海岸的禁区的 3 个大家庭的受影响成员中发现了 D187N 突变。Maury（1991）在其他 6 个表面上不相关的芬兰家庭中发现了 D187N 突变。其中包括 2 名同胞，即 2 名患病父母的后代，他们通过 DNA 测试为突变纯合子，并表现出异常的早期发病和疾病严重程度（莫里，1993 年）。青少年出现蛋白尿，20 多岁出现淀粉样肾病伴肾病综合征。血液透析和肾移植在 30 年代是必要的。相反，在家庭研究过程中，Maury（1991）发现 30 岁的无症状个体具有突变但在检查时有晶格状角膜营养不良的变化（Meretoja（1973）曾建议 2 名患者的受累程度高于平均水平，其父母受累，代表该基因的纯合子。）

Maury（1991）和de la Chapelle 等人（1992 年）在Sack 等人报道的美国苏格兰提取家族中证明了相同的 D187N 突变（1981 年）。莫里等人（1992 年）在 1 名此类患者中提出了纯合子的分子证据。这些似乎是孤立的突变。这种疾病非常罕见，除了芬兰，特殊的历史和人口因素导致了高频率。如果所有情况都证明是由于 asp187 到 asn 突变，那么似乎凝溶胶蛋白分子特定位点的氨基酸序列变化对于使凝溶胶蛋白产生淀粉样蛋白特别关键，也许是独特关键. 戈雷维奇等人（1991）在一名爱尔兰血统的美国患者及其受影响的 31 岁女儿身上发现了 asp187 到 asn 的突变。Purcell 等人已经报道了这个家族（1983 年）。Haltia 等人（1992）描述了 asp187 到 asn 突变的槽印迹分析。保尼奥等人（1992）应用固相微测序测试来确定来自居住在芬兰的 55 个芬兰型家族性淀粉样变性家庭的 94 名受影响者和 32 名健康家庭成员的突变性质。这些家庭约占芬兰所有已知受影响家庭的 34%（55/160）。在所有受影响的个体中，他们发现了 asp187-to-asn 基因。此外，他们在 54%（20/37） 的年轻高危人群中发现了这种突变。Sunada 等人（1993 年）在一个与芬兰或其他高加索人群没有已知接触的大型日本亲属的 14 名成员中发现了与芬兰或 Meretoja 型淀粉样多发性神经病的病因相同的突变。这进一步支持了 asp187 到 asn 突变或同一位置的其他突变是特异性淀粉样蛋白形成的观点。

施泰纳等人（1995）使用基于 PCR 的 DNA 分析，在具有斯堪的纳维亚血统的美国亲属中，在 GSN 基因的第 654 位鉴定了相同的 G 到 A 突变。该突变在临床受影响的先证者、她已故的临床受影响的父亲和她可能受影响的症状前的儿子中得到证实。先证者34岁常规眼科检查发现晶格状角膜营养不良后诊断芬兰型淀粉样变性。38岁无症状，视力正常，无颅神经功能障碍，无周围神经病变，并且没有心脏或肾功能不全的证据。父亲死于 9 年前诊断出的系统性淀粉样变性并发症，享年 77 岁。疾病的表现包括晶格状角膜营养不良，

Paunio 等人对 10 个芬兰家族和 2 个日本家族的芬兰家族性淀粉样变性家族进行单倍型分析（1995）在芬兰家庭的所有疾病相关染色体中证明了一种统一的疾病单倍型，这与在日本家庭中观察到的不同。因此，他们得出结论，这些突变是孤立产生的。

Sipila 和 Aula（2002）报告了芬兰疾病遗传突变的最新数据库的创建，即芬兰人口中比世界其他地区更普遍的 30 多种单基因疾病。他们指出，芬兰型家族性淀粉样变性的所有芬兰病例都有 D187N 突变。

.0002 淀粉样变性，家族性，芬兰型
GSN, ASP187TYR
虽然de la Chapelle 等人（1992）在 2 个非芬兰裔美国家庭和一个荷兰家庭中发现了特征性的 asp187 到 asn 突变（ 137350.0001 ），该家庭具有临床上典型的角膜颅型淀粉样变性（由于 654G-A 转变），他们发现了 654G-T颠换预测丹麦家庭和捷克家庭有相同疾病（105120） 的 asp187-to-tyr取代）。在丹麦和捷克家族中发现了不同的单倍型，这表明突变是孤立发生的。在残基 187 处用不带电荷的极性氨基酸取代酸性天冬氨酸产生了一种 β 折叠构象，该构象可能优先或独特地产生凝溶胶蛋白的淀粉样蛋白。这与转甲状腺素蛋白相关淀粉样变性（ 176300 ）中的各种突变形成对比，但类似于在一些早发性阿尔茨海默病家族中看到的突变，其中涉及 APP 基因中的单个残基（例如，104760.0002 - 104760.0004）。