进行性假肥大性肌营养不良的胚胎植入前遗传学诊断

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进行性假肥大性肌营养不良（ Duchenne musculardystrophy,DMD）是一种临床表现以骨骼肌进行性变性坏死为主的致死性疾病，呈X染色体连锁隐性遗传，在男性活婴中的发病率约为1/3500。

进行性假肥大性肌营养不良遗传模式

这种疾病是典型的X性联隐性遗传，而且致病基因通常由母亲携带，但不会发病。而对于后代，如果是男性则显性发病，成为进行性假肥大性肌营养不良患者；而女性则为终身进行性假肥大性肌营养不良基因的携带者。

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目前认为，DMD的发病原因主要是抗肌萎缩蛋白结构和功能的异常。该蛋白属于细胞膜骨架蛋白，由抗肌萎缩蛋白基因编码，亦为本病的致病基因。患者通常在幼儿或儿童期起病，因肝功能异常进而确诊该病；多在成年前因相关肌肉萎缩进一步导致呼吸、心脏衰竭而死亡。

该基因的突变还可引起临床上症状较轻的一种亚型——贝克肌营养不良（ Becker muscular dystrophy，BMD），一般以12岁是否还能够行走来区分。阅读框规则可解释90%的患者基因型与表型关系：即基因突变若导致编码蛋白提前终止进而产生截短蛋白或产物被降解，则将导致表型严重的DMD；未导致框移突变则可产生有部分功能的蛋白，将导致表现为表型较轻的BMD。

迄今为止，针对DMD/BMD仍无有效治疗方法。因此，应用简便、准确的方法检测致病突变及提供产前诊断或PGD成为预防和减少发病的唯一有效途径。

由79个外显子构成的DAD基因是目前人类已知的最大基因，基因组DNA长度约为2.3 Mb，其主要的突变类型是基因外显子拷贝数异常，以缺失型最为常见，出现异常频率最高的区域为基因中央区域45～55号外显子，另一个缺失热点区位于基因5′端2～20号外显子。所有患者中，大片段的缺失型占60.9%，重复型占9.1%，单核苷酸改变占20.9%。由于DMD基因突变类型多样，且突变在不同的家系中具有孤立性，因此必须采用针对性的基因诊断方法和策略。无论是产前诊断还是孕前PGD，对先证者进行基因分析，明确其致病突变是制定孕前PGD实施途径和策略的前提。

多重连接探针扩增是一种可替代传统多重PCR方法对DMD患者进行外显子缺失、重复检测的技术，由Schouten首先提出。Laing等基于大量DMD患者基因突变分析的结果进行统计，发现当前对DMD/BMD的诊断策略普遍是先对患者进行多重连接探针扩增检测，然后对未发现突变的患者进行基因组DNA序列分析，最后进行肌组织活检确定诊断，并获得抗肌萎缩蛋白mRNA以进行RT-PCR分析DAD基因转录。随着NGS的发展，使同时对DMD基因外显子拷贝数和点突变讲行筛查变得可能。

PGD是替代产前诊断的有效手段，该方法使可能生育某种遗传病患儿的夫妻避免反复多次选择性的终止妊娠。

由于PGD的受检材料为单个卵裂球，其DNA含量极少，因此必须先进行DNA扩增。WGA是一组以单个或数个细胞的全部基因组进行非选择性扩增的技术，目的是通过非倾向性的PCR扩增以指数级别增加DNA的总量。MDA方法是单基因病PGD常用的WGA方法，基本原理是采用多重置换扩增技术对基因组DNA进行稳定扩增。利用随机6个碱基引物在多个位点与模板DNA退火，并利用Phi29 DNA聚合酶扩增的高效率和高保真性，在DNA的多个位点同时起始复制，以原始DNA模板合成DNA，同时取代模板的互补链。被置换的互补链又成为新的模板来进行扩增，因此最终可以获得大量高分子量的DNA，平均长度达10 kb。

DMD的PGD总体策略是尽可能采用直接诊断和间接诊断相结合的方法：首先利用SRY基因及AMEL基因等确定胚胎性别，利用STR和SNP位点确认胚胎是否携带致病的等位基因，即间接诊断；之后，针对不同的突变类型，先证者为缺失型患者可利用多重PCR对男性胚胎进行检测，点突变导致的家系可直接对突变位点进行检测，即直接诊断。另有10%左右无法检出突变及重复导致的家系，仅能通过单体型分析的方法进行间接诊断。日本学者Nakabayashi等曾报道采用实时荧光定量PCR方法检测一个重复型突变家系的PGD，目前国内尚未有类似报道。

DMD基因内部存在9个微卫星位点，分别位于2、7、44、45、49、50、59、63、3′的内含子区域内，为具有不同次数CA碱基重复的STR。一般选择突变区域上下游可提供信息的STR位点作为连锁标记进行单体型分析。过去一般使用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方式区分杂合的连锁标记，然而该方法耗时长，且分辨率有限，当同一位置两个STR位点CA重复次数差距较小时无法判别。因此，可采用荧光标志引物扩增，利用测序仪毛细管电泳的方法进行单体型分析，该方法清晰直观，可区分重复次数仅相差一次的STR位点，且具有检测周期短的优势。

胚胎植入前单倍型分析（PGH）是伴随NGS技术发展而来的新概念，与传统的利用STR作为连锁分析的标志物相比，主要的区别在于其一般选择突变位点上下游1 Mb以内杂合频率较高的SNP位点作为连锁分析的标志物，相较于传统的PCR+Sanger测序方法，NGS技术在寻找SNP位点方面具有低成本、低耗时的特点。

然而，无论采取何种连锁分析的方法，都无法回避双等位基因中某一等位基因随机性的扩增失败造成的ADO现象。ADO给单细胞PCR造成了困扰，并极有可能给PGD结果的判读造成干扰。研究表明，ADO发生率可以高达30%～40%，且单个卵裂球WGA的ADO发生率高于淋巴细胞、极体和成纤维细胞。一般认为SRY基因的脱扣率较为罕见，但Ye等的研究表明，SRY的ADO发生率可能并不像之前预期的那样。由于ADO现象无法避免，因此采用尽可能多的位点进行判别是克服ADO干扰的有效方法。

由于存在ADO或交换，将无可避免地导致PGD存在一定的诊断错误率。因此，建议所有通过PGD成功妊娠的孕妇，均应该在妊娠中期接受羊膜腔穿刺，对胎儿进行产前基因检测，以防止因PGD诊断错误导致的异常婴儿出生。