线粒体柠檬酸合成酶

柠檬酸合酶（CS；EC 4.1.3.7）是三羧酸循环的第一个限速酶，在调节线粒体呼吸的能量产生中起关键作用（Cheng et al., 2009）。

▼ 克隆与表达
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Goldenthal 等人（1998）从人类心脏 cDNA 文库中分离出 CS cDNA。CS 编码 466 个氨基酸的蛋白质，与其猪同源物具有 95% 的同源性。

Liu 等人利用生物信息学鉴定了类似于猪柠檬酸合酶的序列，然后对人类睾丸和骨骼肌 cDNA 文库进行 PCR（2000）克隆的 CS。推导出的 466 个氨基酸的蛋白质包含一个 N 端线粒体靶向序列和一个在柠檬酸合酶中高度保守的基序。在猪、鸡和酵母中检测到接近的直向同源物，柠檬酸合酶基序具有 100% 的保守性。Northern印迹分析检测到心脏和肌肉中的高CS表达，脑、肾脏和胰腺中的中等表达，以及除胸腺和小肠外的所有其他检查组织中的低表达，胸腺和小肠未显示表达。

通过数据库分析，Cheng 等人（2009）确定 CS 基因被转录成 2 个剪接变体，他们称之为 CSa 和 CSb。CSa 缺少外显子 2，编码一种推断的 466 个氨基酸的蛋白质，带有 27 个氨基酸的 N 端线粒体靶向信号，后跟一个催化性 CS 结构域。CSb 包含外显子 2 并编码一个推断的 400 个氨基酸的蛋白质，与 CSa 相比，该蛋白质在 N 端被截短。它缺乏线粒体靶向信号，但具有 CS 域。HeLa 和 HEK293 细胞的 RT-PCR 检测到 CSa 的高表达，而 CSb 几乎没有表达。蛋白质印迹分析检测到表观分子量约为 50 kD 的 CSa。荧光标记的 CSa 定位于线粒体。

▼ 基因功能
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使用小干扰 RNA，Cheng 等人（2009）表明，CSA所需的线粒体前蛋白进口受体TOMM20（601848），TOMM22（607046），和TOMM70（606081），用于线粒体靶向。这些输入受体的组合式导致 CSa 错误定位到细胞质和细胞核。

莱茵等人（2017）发现HEK293T 细胞中 CSKMT（ 617897 ）的过表达增加了 CS 中的赖氨酸甲基化。质谱分析表明成熟 CS 蛋白的 lys368 在过表达 CSKMT 的细胞中被三甲基化。lys368 的三甲基化也在野生型 HAP1 细胞中通过质谱分析显示，但在具有 CSKMT 截断突变体的 HAP1 细胞中未观察到。CSKMT突变体的表达不影响HAP1细胞的增殖或CS蛋白的量或活性。

孤立地，Malecki 等人（2017）研究了 CSKMT 敲除的 HAP1 细胞并获得了与Rhein 等人的发现相似的发现（2017）显示 CSKMT 甲基化 CS。他们表明，在 CSKMT 存在下，CS 前体蛋白中的 lys395（相当于成熟蛋白中的 lys368）变为二甲基化或三甲基化，CSKMT 浓度越高，三甲基化率越高。用精氨酸代替 lys395 的 CS 突变形式消除了甲基化，表明 lys395 是 CS 中唯一的甲基化位点。在各种细胞类型和猪器官中的分析表明 lys395 通常是三甲基化的，但在 HEK293 细胞中观察到所有 4 种甲基化状态。甲基化反应副产物 AdoHcy 浓度的增加降低了 CS 的 CSKMT 依赖性甲基化，而去除 AdoHcy 增加了 CSKMT 甲基化效率。CS 底物 OAA 的存在也抑制了 CSKMT，而 CS 底物乙酰辅酶 A 和 CS 产物柠檬酸不影响 CSKMT 功能。CSKMT 对 CS 的甲基化通过改变 CS 反应的速率而不影响 CS 对 OAA 的亲和力降低了 CS 活性。

▼ 基因结构
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程等人（2009）确定 CS 基因包含 12 个外显子。翻译起始密码子位于外显子 1 和 4。

▼ 测绘
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通过细胞杂交研究，柠檬酸合酶的结构位点被分配到 12 号染色体上（van Heyningen 等，1973；Wijnen 等，1977；Herbschleb-Voogt 等，1978）。通过研究 12pter-p11 的细胞三体性，Mattei 等人（1982）将 CS 分配给 12p11-qter。Goldenthal 等人（1998）证实了 CS 基因定位于 12 号染色体。

通过基因组序列分析，Cheng 等人（2009）将 CS 基因定位到染色体 12q13.2-q13.3。