缺氧诱导食管鳞癌细胞中白细胞介素-7表达促进肿瘤进展

食管癌是常见的消化道肿瘤，中国是食管癌高发国家之一，世界上超过50%的食管癌发生在中国［1-3］。现阶段中国食管癌患者5年生存率为30.3%。食管癌有两种主要的病理学类型，分别为食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）。在中国，食管癌的类型主要为ESCC，占95%以上。临床上治疗ESCC的一线化疗药物主要为顺铂，但是其效果不佳，极易出现耐药。此外，ESCC分子分型不明确，导致很多基于分子靶点开展的靶向治疗的效果仍存在争议。因此，阐明诱导ESCC进展的分子机制将为治疗ESCC提供有效的分子靶点。

缺氧是介导实体瘤进展的重要因素［4］。临床研究［5］显示，缺氧与肿瘤患者不良预后密切相关。在基础医学研究中，缺氧能够诱导肿瘤细胞代谢改变、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及肿瘤干细胞形成，使肿瘤细胞增殖、侵袭、转移能力增强，并产生放化疗抵抗［6-8］。研究［9］发现，缺氧能够诱导肿瘤细胞自分泌细胞因子，进而促进肿瘤进展。本研究将筛选缺氧诱导ESCC细胞中细胞因子表达谱，并重点研究白细胞介素（interleukin，IL）-7对缺氧情况下ESCC进展的影响。

1 材料和方法

1.1　试剂与耗材

IL-7中和抗体（货号：MAB207）及IL-7酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂框（货号：HS750）均购自美国R&D公司，细胞因子阵列蛋白芯片（货号：AAH-CYT-6）及蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）定量ELISA活性检测试剂框（货号：PEL-AKT-S473-T-1）购自美国RayBiotech公司，MTS检测试剂框（货号：G3580）购自美国Progema公司，RPMI-1640培养基（货号：A1049101）及胎牛血清（货号：10099）均购自美国Gibco公司，transwell侵袭小室（货号：CLS3422）购自美国Corning公司。

1.2　细胞培养

人ESCC细胞系KYSE410和KYSE30均由恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室保存。细胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中培养。常氧培养条件为：37 ℃、CO2体积分数为5%。缺氧培养条件为：37 ℃、N2体积分数为94%、CO2体积分数为5%、O2体积分数为1%。

1.3　细胞因子阵列蛋白芯片检测细胞因子分泌

将KYSE410细胞分别置于常氧及缺氧条件下培养。24 h后，收集上清液，将1 mL细胞上清液与包被细胞因子抗体的蛋白芯片于4 ℃过夜温育。之后弃上清液，加入洗液清洗蛋白芯片后，加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（horseradish peroxidase-streptavidin，HRP-SA）室温温育2 h后，洗去HRP-SA，加入显色液曝光显影。

1.4　MTS法检测细胞增殖能力

取对数生长期细胞，以每孔3 000个细胞的密度均匀接种于96孔板中，待细胞贴壁后，置于缺氧培养环境并加入磷酸盐缓冲液（phosphate- buffered saline，PBS）及IL-7中和抗体。48 h后，每孔加入10 μL MTS溶液。使用酶标仪测定490 nm波长处每孔的吸光度（D）值。实验重复5次取平均值。

1.5　侵袭迁移实验

将KYSE410及KYSE30在不含血清的RPMI-1640培养基中于常氧培养条件下培养。12 h后，收集细胞，以每孔10 000/200 μL的密度接种于覆盖（侵袭实验）或不覆盖基质胶（迁移实验）的transwell小室的上室，下室中加入1 mL含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基，缺氧培养条件下培养24 h后取出小室，甲醇固定5 min，结晶紫染色30 min后，擦去上室内的细胞。显微镜下拍照并计数。实验重复5次取平均值。

1.6　ELISA法检测IL-7分泌及AKT活性

在检测IL-7分泌的过程中，将KYSE410及KYSE30细胞分别置于常氧及缺氧培养条件下。24 h后，收集上清液，将20 μL样本与80 μL样本稀释液混匀后，加入96孔板中，室温温育2 h后，洗掉样本。逐步加入一抗稀释液、洗脱、加入HRP-SA、洗脱、加入显色液、置于室温避光温育30 min后，加入终止液，混匀后酶标仪检测D值。实验重复3次取平均值。

在检测AKT活性的过程中，将KYSE410及KYSE30细胞分别置于常氧及缺氧培养条件下。24 h后，收集细胞，用裂解液裂解蛋白，将蛋白裂解液（约20 μg/孔）加入96孔板后，按照试剂框使用说明检测肿瘤细胞AKT活性（磷酸化AKT Ser473的D值/总AKT的D值）。实验重复5次取平均值。

1.7　统计学处理

采用GraphPad Prism 7.0版统计软件进行数据分析。实验数据均以x±s的形式表示。孤立两组间比较使用非配对t检验。量效关系使用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结　　果

2.1　缺氧诱导ESCC细胞中细胞因子及趋化因子表达谱改变

缺氧微环境可以诱导肿瘤细胞中细胞因子分泌增强，但是缺氧对ESCC细胞中细胞因子表达的调控仍未可知。为明确缺氧调控ESCC细胞中哪些细胞因子，本研究采用细胞因子阵列蛋白芯片技术分析常氧状态下ESCC细胞系KYSE410与缺氧状态下KYSE410中的细胞因子表达谱，发现缺氧处理24 h后，KYSE410细胞分泌多种细胞因子，如IL-10、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-7、单核细胞趋化蛋白2（monocyte chemoattractant protein 2，MCP2）、C-C趋化因子配体（C-C motif chemokine ligand，CCL）5、CCL17、CCL18及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等。这些细胞因子均与肿瘤进展关系密切，参与肿瘤细胞增殖、侵袭转移、血管新生及免疫细胞对肿瘤细胞的作用。其中，ESCC细胞在缺氧状态下IL-7的分泌增高最为明显（图1）。

2.2　缺氧诱导ESCC细胞中IL-7分泌增强

进一步研究缺氧是否可以介导ESCC细胞中IL-7分泌增多，以常氧条件培养的KYSE410、KYSE30细胞系为常氧组，缺氧24 h培养的KYSE410、KYSE30细胞系为缺氧组，并通过ELISA法分析两个细胞系中IL-7的分泌情况。ELISA法实验结果显示，缺氧显著诱导ESCC细胞系中IL-7的分泌。对照组KYSE410细胞IL-7分泌量为（275.70±82.98）pg/mL，实验组KYSE410细胞IL-7分泌量为（2 451.00± 87.90）pg/mL，差异有统计学意义（P<0.001）；对照组KYSE30细胞IL-7分泌量为（325.80±85.46）pg/mL，实验组KYSE410细胞IL-7分泌量为（2 653.00±126.70）pg/mL，差异有统计学意义（P<0.001，图2）。

图 1　缺氧诱导KYSE410细胞中细胞因子表达谱改变

Fig. 1 Hypoxia induced the expression profile of cytokines and chemokines of KYSE410 cell

图 2　缺氧诱导KYSE410及KYSE30细胞中IL-7分泌增强

Fig. 2 Hypoxia induced the IL-7 secretion from KYSE410 and KYSE30 cells

ELISA assay was used to assess the IL-7 secretion from KYSE410 and KYSE30 cells under normoxic or hypoxic condition for 24 h.

*: P<0.001, compared with normoxia

2.3　IL-7中和抗体抑制缺氧状态下ESCC细胞的增殖

在缺氧状态下（48 h），以PBS为对照，采用不同浓度的IL-7中和抗体（5、10 μg/mL）处理KYSE410及KYSE30细胞。MTS实验结果显示，IL-7中和抗体能够剂量依赖性地抑制ESCC细胞系增殖。对照组KYSE410细胞相对增殖率（与本组比较）为1.000±0.055，IL-7中和抗体（5 μg/mL）处理KYSE410细胞组相对增殖率（与对照组比较）为0.610±0.026，差异有统计学意义（P<0.001）。IL-7中和抗体（10 μg/mL）处理KYSE410细胞组相对增殖率（与对照组比较）为0.326±0.022，差异有统计学意义（P<0.001）。对照组KYSE30细胞相对增殖率（与本组比较）为1.000±0.036，IL-7中和抗体（5 μg/mL）处理KYSE30细胞组相对增殖率（与对照组比较）为0.673±0.019，差异有统计学意义（P<0.001）。IL-7中和抗体（10 μg/mL）处理KYSE30细胞组相对增殖率（与对照组比较）为0.359±0.017，差异有统计学意义（P<0.001，图3）。

图 3　IL-7中和抗体抑制缺氧状态下KYSE410及KYSE30细胞的增殖

Fig. 3 IL-7 neutralizing antibody inhibited proliferation of KYSE410 and KYSE30 cells under hypoxia

MTS assay was applied to evaluate the growth ability of KYSE410 and KYSE30 cells treated with PBS（control solvent）, or IL-7 antibody（5, 10 μg/mL）, under hypoxia for 2 d. *: P<0.001, compared with control group

2.4　IL-7中和抗体抑制缺氧状态下ESCC细胞的侵袭及迁移

Transwell实验结果显示，相比对照组，随着IL-7中和抗体（5、10 μg/mL）浓度的增高，缺氧状态下，ESCC细胞系KYSE410及KYSE30侵袭及迁移能力显著降低。侵袭实验结果显示，对照组KYSE410细胞相对侵袭率（与本组比较）为1.000±0.117，IL-7中和抗体（5 μg/mL）处理KYSE410细胞组相对侵袭率（与对照组比较）为0.388±0.070，差异有统计学意义（P<0.001）。IL-7中和抗体（10 μg/mL）处理KYSE410细胞组相对侵袭率（与对照组比较）为0.174±0.025，差异有统计学意义（P<0.001）。对照组KYSE30细胞相对侵袭率（与本组比较）为1.000±0.090，IL-7中和抗体（5 μg/mL）处理KYSE30细胞组相对侵袭率（与对照组比较）为0.433±0.040，差异有统计学意义（P<0.001）。IL-7中和抗体（10 μg/mL）处理KYSE30细胞组相对侵袭率（与对照组比较）为0.210±0.037，差异有统计学意义（P<0.001，图4A）。迁移实验结果显示，对照组KYSE410细胞相对迁移率（与本组比较）为1.000±0.162，IL-7中和抗体（5 μg/mL）处理KYSE410细胞组相对迁移率（与对照组比较）为0.450±0.080，差异有统计学意义（P<0.001）。IL-7中和抗体（10 μg/mL）处理KYSE410细胞组相对迁移率（与对照组比较）为0.163±0.028，差异有统计学意义（P<0.001）。对照组KYSE30细胞相对迁移率（与本组比较）为1.000±0.100，IL-7中和抗体（5 μg/mL）处理KYSE30细胞组相对迁移率（与对照组比较）为0.272±0.063，差异有统计学意义（P<0.001）。IL-7中和抗体（10 μg/mL）处理KYSE30细胞组相对迁移率（与对照组比较）为0.160±0.049，差异有统计学意义（P<0.001，图4B）。

2.5　IL-7中和抗体抑制缺氧状态下ESCC细胞中信号分子AKT的活性

本研究通过ELISA法分析缺氧对ESCC细胞系中AKT活性的影响，结果显示，缺氧24 h后，ESCC细胞系KYSE410及KYSE30中AKT Ser473活性显著上调（图5A）。对照组KYSE410细胞AKT活性为0.454±0.019，实验组KYSE410细胞AKT活性为0.744±0.047，差异有统计学意义（P<0.001），对照组KYSE30细胞AKT活性为0.462±0.037，实验组KYSE30细胞AKT活性为0.809±0.064，差异有统计学意义（P<0.001，图5A）。外加IL-7中和抗体能够有效地抑制KYSE410及KYSE30细胞中AKT Ser473的磷酸化激活（图5B）。对照组KYSE410细胞AKT活性为0.756±0.058，IL-7中和抗体（5 μg/mL）处理KYSE410细胞组AKT活性为0.441±0.038，差异有统计学意义（P<0.001）。IL-7中和抗体（10 μg/mL）处理KYSE410细胞组AKT活性为0.214±0.028，差异有统计学意义（P<0.001）。对照组KYSE30细胞AKT活性为0.815±0.082，IL-7中和抗体（5 μg/mL）处理KYSE30细胞组AKT活性为0.472±0.04，差异有统计学意义（P<0.001）。IL-7中和抗体（10 μg/mL）处理KYSE30细胞组AKT活性为0.234±0.029，差异有统计学意义（P<0.001，图5B）。

图 4　IL-7中和抗体抑制缺氧状态下KYSE410及KYSE30细胞的侵袭转移

Fig. 4 IL-7 antibody inhibited invasion or migration of KYSE410 and KYSE30 cells under hypoxia

Invasion（A） or migration（B） assay was used to evaluate the invasive abilities of KYSE410 and KYSE30 cells treated with PBS（control solvent）, or IL-7 antibody（5, 10 μg/mL）, under hypoxia for 24 h. *: P<0.001, compared with control group

图 5　IL-7中和抗体抑制缺氧状态下KYSE410及KYSE30细胞中AKT活性

Fig. 5 IL-7 antibody inhibited the AKT activity of KYSE410 and KYSE30 cells under hypoxia

A: Quantitative ELISA assay was used to evaluate the D value of pAKT Ser473/the D value of total AKT（AKT activity） in KYSE410 and KYSE30 cells under normoxic or hypoxic condition for 24 h. B: Quantitative ELISA assay was applied to examine the AKT activity in KYSE410 and KYSE30 cells treated with PBS（control solvent）, or IL-7 antibody（5, 10 μg/mL）, under hypoxia for 24 h. : P<0.001, compared with normoxia; *: P<0.001, compared with control group

3 讨　　论

本研究显示，缺氧可诱导ESCC细胞中多种细胞因子及趋化因子的自分泌表达，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-10、MCP2及CCL5等。

其中，TNF-α、IL-1β及IL-10是慢性炎症与肿瘤关联的重要细胞因子，这些因子的多态性与肿瘤进展关系密切［10］。IL-6能够通过调控肿瘤细胞可塑性、介导化疗耐药，进而促进肿瘤进展。肿瘤微环境释放的CCL5，能够通过作用于肿瘤细胞中相应受体CCR5，介导肿瘤的多种恶性表型［11］。因此，细胞因子的活性增强是调控肿瘤进展的重要因素之一。

本研究重点阐明了IL-7作为缺氧诱导细胞因子，介导ESCC进展及相关分子机制。IL-7能够产生广泛免疫效应，在免疫细胞活化过程、产生免疫应答效应、调控自身免疫性疾病及抗纤维化中具有重要作用，是细胞因子研究领域的热点因子。在肿瘤学领域，IL-7与肿瘤关系复杂。其中，IL-7参与多种免疫细胞对肿瘤生长增殖的调控。在嵌合抗原受体T（chimeric antigen receptor T，CAR-T）细胞免疫疗法中，CAR-T细胞中高表达的IL-7能够增加免疫细胞在局部实体瘤的浸润并增强CAR-T细胞的抗癌效应［12］。但是，IL-7的受体IL-7R是一个重要的癌基因，IL-7/IL-7R轴能够通过调控肿瘤细胞中细胞周期蛋白D1的表达，进而促进肿瘤细胞增殖并抵抗凋亡［13］。在细胞实验中，加入IL-7重组蛋白能够通过激活前列腺癌细胞中AKT/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号转导通路，进而增强基质金属蛋白酶（ matrixmetalloproteinase，MMP）-3及MMP-9分泌，促进前列腺癌细胞侵袭能力的增强［14］。本研究显示，缺氧ESCC细胞中自分泌产生的IL-7能够介导肿瘤细胞增殖、侵袭及转移，拮抗IL-7的功能显示，抑制缺氧状态下ESCC细胞的增殖、侵袭及转移，证实IL-7是介导肿瘤细胞在缺氧微环境中进展的重要细胞因子。

研究［15］显示，细胞因子介导肿瘤进展主要与激活肿瘤细胞中的信号通路有关。IL-6可以通过激活JAK家族激酶/信号转导与激活转录因子通路促进多种肿瘤进展，且此信号轴是肿瘤治疗中重要的靶点信号轴。多种细胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-8、MIP2及CCL2等，均与肿瘤细胞中NF-κB信号通路的激活及多种恶性细胞表型的形成密切相关［16］。有研究［17-18］显示，IL-7能够通过激活信号通路促进肿瘤进展，如磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/AKT通路及JAK1/Stat5信号转导通路。AKT是介导ESCC进展最重要的信号分子，本研究结果显示，拮抗IL-7的功能能够显著抑制缺氧条件下ESCC细胞中AKT的活性，但IL-7能否也通过调控其他信号分子，进而诱导ESCC进展仍有待于进一步研究。

本研究通过蛋白芯片技术研究缺氧介导ESCC细胞中细胞因子的表达情况，并研究了IL-7对缺氧促进ESCC进展的影响及相关分子机制，为深入研究缺氧-细胞因子轴介导肿瘤进展提供了新思路。

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