ARHGAP4通过调控HK2表达促进肝癌细胞生长的研究

欧阳晓春，邹叶青，李玉梅，丁小兵

1.中国人民解放军联勤保障部队第908医院神经内科，江西南昌 330006；

2.南昌大学第二附属医院江西省重点分子实验室，江西南昌 330006；

3.井冈山大学医学部，江西吉安 343000

原发性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上较为常见的肿瘤之一，在中国，其发病率一直居高不下^［1-2］。尽管近年来医学临床检验技术及HCC治疗方法取得了巨大进展，然而HCC患者的5年生存率却一直徘徊不前，很多根治性HCC切除术后复发率依旧很高^［3］，究其原因主要是HCC细胞生长迅速，易发生转移^［4］，因此，探索HCC细胞生长迅速的机制对于HCC的治疗尤为重要。

　　Rho GTP酶活化蛋白4（Rho GTPase activating protein 4，ARHGAP4）属于Rho家族蛋白的负调节因子，它可以水解将GTP纳入非活跃GDP并进行负调控^［5］。有研究^［6］报道，ARHGAP4通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）和低氧诱导因子-1&α;（hypoxia inducible factor-1&α;，HIF-1&α;）信号通路调节胰腺癌代谢并进一步促进胰腺癌的生长，另外有研究^［7-9］也证实了ARHGAP4在头部和颈部鳞状细胞癌、胶质母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌和前列腺癌的表达情况，然而在HCC细胞中ARHGAP4的表达及其是否影响HCC生长的情况并不清楚。

　　糖代谢异常是肿瘤细胞的一个重要特征，赋予肿瘤特异增殖和迁移的能力，糖酵解为细胞提供充足的能量，可显著增强肿瘤细胞对缺血及缺氧的耐受性，能够避免由于氧化磷酸化受抑制而导致细胞的凋亡^［10-11］。有研究^［12-14］证实，肿瘤细胞中糖酵解增强与糖酵解限速酶活性增强有关，己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）作为糖酵解过程中的限速酶，在肿瘤的生长过程中发挥着重要作用，HK2在结肠癌、膀胱癌和多形性胶质母细胞瘤中的表达量均明显升高，且与肿瘤的恶性程度成正比，同时过表达HK2能明显促进肿瘤细胞的增殖、耐药和体内肿瘤的生长。虽然目前已有研究证实了HCC组织中HK2的表达升高^［15］，但其机制仍有待进一步研究。因此，本研究旨在探讨ARHGAP4及HK2在HCC组织中的表达及对HCC细胞生长的影响并进一步了解两者间的相互作用关系。

材料和方法

1.1 主要试剂

　　胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）及DMEM培养基购自美国Gibco公司，胰蛋白酶酶、磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）、青霉素-链霉素（双抗）均购自美国BI公司，RIPA裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid disodium，BCA）及蛋白抽提试剂框均购自上海碧云天生物技术有限公司，ECL发光试剂购自北京全式金生物技术有限公司，凋亡试剂框购自美国BD公司，ARHGAP4、HK2、GAPDH等主要抗体购自英国Abcam公司，Lipofectamine^TM3000购自美国Thermo Fisher公司，细胞培养所需耗材购自美国Next公司。

1.2 细胞培养及转染

　　HCC细胞系MHCC97H、HCCLM3均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，所有细胞均置于含有10%FBS的完全培养基中，隔天换液，待细胞生长至80%~90%时给予1∶3传代，培养条件为：37 ℃、CO2体积分数为5%及湿度约为95%的细胞培养箱。

　　取对数生长的HCC细胞，将细胞以1×10⁶接种于6孔培养板中，待细胞生长至60%~70%时予以无血清的培养基每孔2 mL，以每孔7.5 μL Lipofectamine^TM3000及shRNA加入含2 mL无血清的培养皿中，于6 h后更换成含有10%FBS的完全培养基，继续于细胞培养箱中培养，24~36 h后提取细胞RNA，48~72 h后提取细胞总蛋白。

1.3 组织标本

　　经南昌大学医学伦理审查委员会批准，并经过全部患者知情同意后，收集了南昌大学第二附属医院及中国人民解放军联勤保障部队第908医院的62例经HCC切除术标本及其癌旁组织，每例标本都经病理学检查确诊为HCC标本及癌旁组织。

1.4 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

　　采用TRIzol法提取细胞及组织RNA，通过紫外分光光度计检测各组的RNA浓度，按照宝生物工程（大连）有限公司的反转录试剂框说明要求进行反转录制备cDNA，并进一步进行RTFQ-PCR，每个样品至少设置3个复孔，测定其Ct值并进行计算。

1.5 蛋白质印迹法（Western blot）

　　收集细胞及组织蛋白质，经RIPA裂解液及蛋白质抽提试剂框分别提取细胞及肿瘤组织总蛋白，经BCA定量后将蛋白质样品于沸水中煮10 min，于10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离，孤立的蛋白质条带通过电印迹转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜中，经脱脂牛奶封闭后，与对应的一抗进行杂交温育（4 ℃过夜），并与对应来源性的二抗进行杂交温育（1 h），经ECL发光试剂显影后拍照分析。

1.6 细胞计数试剂框（cell counting kit-8，CCK-8）

　　取对数生长的HCC细胞MHCC97H及HCC-LM3细胞，经胰蛋白酶消化计数后，接种1×104个细胞于96孔板中，给予对应的处理24 h后，每孔加入CCK-8试剂10 μL，于细胞培养箱中培养2 h，最后置于酶标仪于450 nm波长处测量其吸光度（D）值并分析。

1.7 EdU

　　细胞处理方法同上，每孔加入100 μL EdU培养基于细胞培养箱中继续培养2 h，随后加入100 μL 4%多聚甲醛溶液固定30 min，每孔加入100 μL甘氨酸，加入100 μL Apollo和100 μL 0.5%Triton-X，100 μL PBS洗两遍，100 μL Hoechst33342避光、室温下脱色摇床30 min，100 μL PBS洗两遍，采用荧光显微镜观察细胞增殖情况并拍照记录分析。

1.8 流式细胞术测定细胞凋亡实验

　　按照shNC、shARHGAP4进行分组，经胰蛋白酶消化后收集细胞沉淀，2 mL PBS清洗细胞两遍，根据细胞凋亡试剂框步骤说明，分别加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）及异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）染料，上流式细胞仪检测。

1.9 统计学处理

　　所有实验数据均采用SPSS 19.0和GraphPad Prism7数据软件进行分析。当两组比较时，采用t检验分析两组间的差异，采用单因素方差分析比较两组间的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

2.1 ARHGAP4在HCC中的表达及其与临床预后的关系

　　为了检测HCC组织中ARHGAP4的表达情况，我们收集了62例患者HCC组织及其相应的癌旁组织，首先通过RTFQ-PCR分析了HCC组织和癌旁组织中ARHGAP4的mRNA表达，结果显示，HCC组织标本中ARHGAP4的mRNA表达显著提升（P＜0.01，图1A），进一步通过Western blot及免疫组织化学法分析了ARHGAP4的蛋白质水平，结果表明，HCC组织标本中ARHGAP4的蛋白质水平显著高于癌旁组织（图1B~C），进一步分析了ARHGAP4的表达与临床病理学特征的关系，结果表明，ARHGAP4高表达与肿瘤大小及TNM分期密切相关（P＜0.05，表1），最后通过TCGA数据库分析了ARHGAP4与预后之间的关系，结果表明，高表达ARHGAP4的HCC患者预后差（图1D）。以上结果表明ARHGAP4在HCC组织中高表达且与患者预后密切相关。

图 1 ARHGAP4在HCC中的表达及其与临床预后的关系

Fig. 1 Expression of ARHGAP4 in HCC and its relationship with clinical prognosis

A-B: Quantitative RTFQ-PCR and Western blot were used to analyze the expression level of ARHGAP4 in HCC and adjacent tissues; C: Western blot was used to analyze the expression level of ARHGAP4 in HCC and adjacent tissues; D: The TCGA database was used to analyze the relationship between ARHGAP4 expression and prognosis in HCC. **: P<0.01, compared with each other; T: Tumor; NT: Non-tumor

2.2 抑制HCC细胞中ARHGAP4的表达显著抑制其生长

　　为了明确ARHGAP4参与HCC细胞的生长调节过程，首先在HCC细胞中沉默ARHGAP4的表达，利用RTFQ-PCR及Western blot证实ARHGAP4下调成功（P＜0.01，图2A~B）。然后进行shNC、shARHGAP4分组，利用CCK-8及EdU实验检测了HCC细胞增殖情况。结果显示，沉默HCC细胞中ARHGAP4的表达后，HCC细胞增殖明显减弱（P＜0.01，图2C~D）。进一步采用流式细胞术细胞凋亡实验分析下调ARHGAP4后HCC细胞的凋亡情况，结果表明，HCC细胞凋亡比例显著增加（P＜0.05，图2E~F）。以上结果表明，沉默ARHGAPE能够显著抑制HCC细胞的生长并促进HCC细胞的凋亡。

图 2 抑制HCC细胞中ARHGAP4的表达显著抑制其生长

Fig. 2 Suppression of ARHGAP4 expression in HCC cells significantly inhibited proliferation of HCC cells

A: RTFQ-PCR detected ARHGAP4 silencing effect; B: Western blot was used to verify ARHGAP4 silencing effect; C: CCK-8 detection after ARHGAP4 down-regulation of cell proliferation; D: EdU cell proliferation was detected after silencing ARHGAP4; E: Flow cytometry was used to detect the apoptotic rate of ARHGAP4 after silencing; F: The expression of apoptosis-related protein 半胱天冬酶-3 was detected by immunoblotting after silencing of ARHGAP4. *: P<0.05, compared with the other group; **: P<0.01, compared with the other group; ***: P<0.001, compared with the other group

2.3 ARHGAP4调控HK2的表达且两者表达呈正相关

　　首先在HCC细胞中沉默ARHGAP4的表达，结果发现HK2的表达也随之下降，相反过表达ARHGAP4后HK2的表达显著上升（图3A~B，P＜0.01）。接下来通过RTFQ-PCR及Western blot证实了HK2在HCC中高表达（图3C~D，P＜0.01）。进一步研究发现，ARHGAP4的表达与HK2呈正相关（图3E，P＜0.01）。

图 3 ARHGAP4调控HK2的表达且两者表达呈正相关

Fig. 3 ARHGAP4 regulates HK2 expression and expressions of ARHGAP4 and HK2 are positively correlated

A-B: After silencing and overexpressing ARHGAP4, the expression levels of HK2 mRNA and protein in HCC cells were detected by RTFQ-PCR and Western blot; C-D: The expression levels of HK2 in HCC tissues and their adjacent tissues were detected by RTFQ-PCR and Western blot; E: Correlation analysis between ARHGAP4 and HK2 in HCC. **: P<0.01, compared with each other; T: Tumor; NT: Non-tumor

2.4 ARHGAP4调控HCC细胞的生长依赖于HK2的表达

　　为了进一步明确ARHGAP4调控HCC细胞生长的具体机制，在稳定低表达ARHGAP4的HCC细胞中同时过表达HK2，Western blot结果显示，ARHGAP4表达降低，而HK2表达抑制在过表达HK2后恢复（图4A），同样，HCC细胞的增殖能力同样恢复（图4B）。接下来上调ARHGAP4的表达，HCC的生长能力及HK2的表达显著提升。进一步在过表达ARHGAP4的同时沉默HK2的表达，结果表明，ARHGAP4的蛋白质水平上升，而HK2的表达及HCC细胞生长能力在HK2沉默后被抑制（图4C~D）。以上结果表明，ARHGAP4调控HCC细胞的生长能力依赖于HK2的表达。

图 4 ARHGAP4调控HCC细胞的生长依赖于HK2的表达

Fig. 4 ARHGAP4 regulates the growth of HCC cells via HK2 expression

A: Western blot analysis of the expressions of ARHGAP4 and HK2 in HCC cells. Overexpression of HK2 could restore the inhibition of HK2 by shARHGAP4. B: EdU results showed that overexpression of HK2 could restore the inhibition of proliferation of shARHGAP4 by HCC. C: Western blot analysis of the expressions of ARHGAP4 and HK2 in HCC cells. Silencing HK2 could inhibit the up-regulation of p-ARHGAP4 HCC cells on HK2. D: EdU results confirmed that silencing HK2 could inhibit p-ARHGAP4 to promote the growth of HCC cells. *: P<0.05, compared with the other group; **:P<0.01, compared with the other group

讨　　论

　　HCC严重影响人类健康，许多研究者密切关注HCC的发生、发展，目前普遍认为细胞的恶性生长是癌症的必要环节^［16］。越来越多的证据表明，HCC细胞的增殖和凋亡与原癌基因和抑癌基因异常表达密切相关^［17］。Rho GTP酶活化蛋白基因与肿瘤的发生、发展相关，其中以ARHGAP4尤为重要，目前有研究^［18］证实，ARHGAP4在胰腺癌等多种肿瘤中高表达，沉默肿瘤细胞中ARHGAP4的表达后显著抑制肿瘤细胞的增殖能力并诱导细胞周期阻滞，进而促进肿瘤细胞凋亡。另外有研究^［18］也报道了ARHGAP4的表达与胰腺癌细胞的糖酵解水平相关。然而在HCC中尚未见报道，本研究检测了ARHGAP4在HCC组织中的表达，并探讨了ARHGAP4的表达与HCC细胞生长的关系。

　　糖酵解作为肿瘤细胞中大部分的能量来源，已经有越来越多的研究^［19-21］证实在不同的肿瘤细胞中存在着糖酵解增强的现象。Lee等^［19］研究发现，在HCC中糖酵解增强，且主要与其关键酶HK2的活化相关。Wang等^［20］也发现，在膀胱癌中同样存在着HK2高表达，并发现HK2作为孤立影响因子影响着膀胱癌的进展。Lv等^［21］研究发现，在肺癌的组织标本中同样存在着HK2表达升高，并且显著影响其生长与转移。本研究数据表明，HK2在HCC组织中高表达，降低HCC细胞中ARHGAP4的表达后HK2表达被抑制，且两者呈正相关。总之，这些数据表明，ARHGAP4可能作为致癌基因发挥重要作用，并可能在HCC的发生、发展中发挥重要作用。虽然本研究观察了ARHGAP4对HCC生长的影响，但并未揭示其调控增殖的具体机制。

　　综上所述，ARHGAP4能够正向调控HK2的表达进而促进HCC的生长，可望为HCC的靶向治疗提供新的线索。