女性AMH对怀孕的影响

一、AMH综述
1.1 AHM化验单示例

一般而言，AMH检测在三甲医院都可以做。检测周期一般在一周以内，根据医院的实际情况而定，快的当天就可以出结果。

AMH检测目前都只能在医院和实验室进行，所谓“家庭检测”是指在家中采血，并把样本寄回医院。试剂框本身不具备检测功能，其功能主要是保存血样。
1.2 AMH参考值

表1 AMH年龄与参考值范围年龄（岁）< 3031~3536~4041~4546~50绝经前和绝经期参考范围（ng/ml）2.5~6.31.88~6.081.71~5.30.78~3.560.76~2.8检测不出
1.3 AMH简介

AMH即抗缪勒管激素（anti-Müllerian hormone）,又称缪勒管抑制物（Müllerianinhibiting substance，MIS），由AlfredJost教授在二十世纪四十年代发现。

AMH检能够可靠、快速地评价卵巢储备功能，得知女性卵巢中可能形成窦性卵子的数目，从而得知女性的生殖能力以及更年期的开始时间。

AMH在评估卵巢储备方面有很多明显的优点，是卵巢衰老最准确的生物标志物。AMH比FSH、雌二醇（estradiol,E2）、抑制素B（inhibinB, inhB）和窦卵泡计数（antra1 follicle count,AFC）更早反映卵巢储备随年龄下降的趋势，且其水平不受月经周期、激素类避孕药和怀孕的影响。AMH在女性月经周期内的波动远小于其他性激素，故现有指南多支持在月经周期任意时间检测AMH。

因此，AMH是卵巢储备功能指标中最为可靠稳定和方便的一个。

二、AMH临床应用研究最新进展

AMH是由女性卵泡颗粒细胞和男性睾丸支持细胞所分泌的二聚体糖蛋白激素。 AMH在辅助生殖领域中, 可作为卵巢储备功能、促排卵治疗过程中卵巢反应性的预测指标, 同时可作为体外受精（in-vitro fertilization, IVF）受精率及临床妊娠率的预测指标。此外, AMH还可用于评估精子质量及精子冷冻保存后的活力恢复情况。AMH还可辅助诊断女性卵巢功能早衰（premature ovarian failure, POF）及多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome, PCOS） , 辅助鉴别男性严重少、弱精子症及无精子症, 指导生育期肿瘤患者选择治疗方案等。
2.1 AHM的作用

AMH首次被发现于胚胎的睾丸细胞中, 现已证实AMH在性腺发育及性别分化过程中有重要作用。有研究发现AMH有参与调控下丘脑-垂体-性腺轴（hypothalamicpituitary-gonad axis, HPGA）、刺激女性青春期前体内卵泡刺激素（follicle stimulating hormone, FSH）分泌的作用。男女性别的胚胎于不同时期完成性分化, 在性分化初期, 中肾管和苗勒管同时存在。在男性胚胎形成的第8周, Y染色体上的性别决定基因（ser determining region of Y 染色体, SRY）产生睾丸决定因子（testis determining factor, TDF） , 促使原始性腺分化为睾丸, 睾丸间质细胞产生的雄激素刺激中肾管分化成为附睾、输精管、精囊腺和射精管, 睾丸支持细胞产生的AMH具有抗苗勒管生长的作用, 进而使苗勒管萎缩。而在无Y染色体、无AMH及雄激素作用时, 胚胎于13周左右开始分化为卵巢, 苗勒管分化、发育成为输卵管、子宫及阴道上部, 中肾管逐渐萎缩。

女性体内的AMH最早发现于32周胎儿的卵巢颗粒细胞中, 自此至围绝经期作用于原始卵泡细胞的生长和调控, 血清中AMH水平自青春期后维持在较稳定的水平并缓慢下降, 直至围绝经期卵泡储备枯竭。目前的研究发现, AMH在卵泡的发育、选择性生长中均发挥着重要作用, 具有抑制原始卵泡的募集, 阻断卵泡减数分裂进行的作用, 同时, AMH还具有抑制芳香化酶活性、降低卵泡对FSH的敏感性以及抑制颗粒细胞中黄体生成激素（luteotropic hormone, LH）受体生成的作用, 以防止卵泡池过快耗竭。AMH的合成主要依赖于窦前卵泡和小窦卵泡的颗粒细胞, AMH在初级卵泡的颗粒细胞中呈均匀的表达, 并于次级卵泡、窦前卵泡的颗粒细胞中呈递增趋势, 在直径<6 mm的窦前卵泡和小窦卵泡中达到峰值, 当卵泡直径>8 mm时AMH表达水平随即骤降, 卵泡发育进入FSH依赖阶段, 并于依赖FSH水平发育的最后阶段及闭锁卵泡中呈现不表达状态[8,9]。

男性自胎儿期即开始由睾丸支持细胞表达AMH, 出生后即缓慢升高并维持在稳定的高水平。进入青春期后, 由于睾丸组织中的血睾屏障, 大分子的AMH不易进入血清中, 血清中的AMH水平随即显著降低, 因此精浆中的AMH水平显著高于血清中的AMH水平。有研究发现, 男性血清中的AMH表达水平与睾酮含量呈负相关, 血清中AMH的过度表达及较低的睾酮含量提示睾丸间质细胞发育不良, 该研究还认为, AMH可能是通过调控特定的裂解酶活性来影响睾丸间质细胞产生睾酮, 但这一观点仍尚待证实。
2.2 AHM对评估卵巢储备功能评估的意义

卵巢储备功能包括原始卵泡数量及质量两个方面。在此前, 临床上常以监测窦卵泡数（antral follicle count, AFC）或测量卵泡期血清FSH、雌二醇（estradiol, E2）及抑制素B（inhibin B, INH-B）水平来评估个体的卵巢储备功能, 然而, 基于HPGA的调控, 这些指标具有较强的周期性和激素依赖性且不相互孤立存在。此前, Cook等通过监测月经周期不同阶段的血清AMH水平进行分析, 发现血清AMH水平在自然月经周期中不同阶段无明显差异。最近也有学者同样提出, 血清AMH水平无周期差异性, 并能优于FSH、E2、INH-B和AFC更早地反映出卵巢储备功能随年龄增长呈现的下降趋势。此外, 由于AMH不受HPGA及外源性激素及其类似物的影响, 作为卵巢储备功能评估中较稳定可靠的一项指标, 多数指南已支持对AMH的检测时期无特殊要求, 且支持AMH水平显著降低对于辅助诊断卵巢储备功能下降（diminished ovarian reserve, DOR）甚至POF的指导价值。

现已有众多研究证实, AMH对评估卵巢储备有指导意义。然而, 近期一项针对无不孕病史的30岁以上育龄期女性的研究却显示, 不同AMH水平者的自然妊娠率比较, 差异无统计学意义。因此, AMH水平是否能作为重要指标用于指导不孕患者的诊治有待进一步研究。
2.3 AMH在卵巢治疗中的参考意义

在生殖医学门诊中, 常见到包括多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome, PCOS）在内的一群有排卵障碍以致不孕的患者, 而促排卵治疗至关重要。已有大量研究显示, PCOS患者窦前卵泡数及小窦卵泡数较正常人群明显增多, 这可能是造成PCOS患者血清AMH水平相对较高的原因之一。此外, 也有很多研究指出, PCOS患者颗粒细胞中的AMH m RNA表达水平明显高于正常人群, 这亦是导致卵泡液中AMH水平显著升高的可能原因[15,16]。现临床上针对排卵障碍的患者常用的促排卵方案包括促排卵口服药、促排卵针剂及联合用药等。Mumford等针对排卵障碍的不孕患者进行研究发现, 无论予以口服氯米芬还是来曲唑进行促排卵治疗, 对于AMH水平较高的患者, 周期内所需的药物剂量相对于AMH水平正常的患者均较高。Amer等也同样对排卵障碍的PCOS患者进行分组, 回顾性分析了AMH水平高者及AMH水平正常者的人绝经期促性腺激素（human menopausal gonadotropin, HMG）针剂促排卵方案, 结果也同样显示, AMH水平较高者所需的HMG的初始剂量及总剂量相对较大, 周期促排卵的时间也相对较长。由此可见, 在门诊促排卵方案的选择中, 对于基础AMH水平较高者, 可以考虑给予较大的初始剂量以达到相对较好的促排卵效果。

在控制性超促排卵（controlled ovarian hyperstimulation, COH）的临床研究中, 对AMH水平较低的不孕患者予以常规COH方案通常仅能得到卵巢低反应结局, 且周期重组FSH（r FSH）总剂量及平均日用剂量均较高。
2.4 AMH在试管婴儿医疗中的参考意义

如今, 越来越多的研究者开始探讨体外受精（in-vitro fertilization, IVF）治疗前的疗效预估, 包括预估卵巢反应性、预测IVF结局等。有研究者对COH受试者数据进行统计, 根据卵巢反应性分为低反应组、正常反应组及高反应组, 同时测定受试者取卵日血清及优势卵泡的卵泡液中AMH水平, 进而对AMH水平与促排卵药物总剂量、E2水平及获卵数进行相关性分析显示:血清、卵泡液中的AMH水平在卵巢低反应组、正常反应组、高反应组间呈递增趋势（P<0.001） [20,21], 因此, 有研究者提出, 在预测卵巢低反应的各项指标中, AMH具有较高的准确性, 可作为孤立预测指标。Laura等通过分析IVF短方案的受试者不同阶段血清AMH水平及取卵日卵泡液中AMH水平发现, 卵泡早期血清AMH水平与AFC、获卵数皆呈正相关, 卵巢过度刺激综合征（ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS）患者血清、卵泡液中的AMH水平显著高于正常人群, 将血清基础AMH为1.5 ng/mL、卵泡液AMH为2.7 ng/mL作为临界值预测OHSS的发生[受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线下面积分别为0.79和0.73, 均P<0.001]。因此, 血清、卵泡液中的AMH水平可能作为预测卵巢反应性、预估获卵数及预防OHSS的指标, 从而个性化ART促排卵方案, 降低周期取消率[20,21]。

此外, 有研究显示, 血清AMH水平与IVF受精率、临床妊娠率呈正相关。血清AMH水平亦可用于预测胚胎质量。而Goswami等的研究则显示, 在年龄≤35岁的妇女中, 血清AMH水平与IVF结局间并未发现相关性, 而在年龄>35岁的妇女中, 较高的AMH水平常伴随着较高的临床妊娠率及活产率。同样, Chen等也通过对AMH水平与受精率、临床妊娠率及活产率进行相关性分析, 却未得出血清AMH及卵泡液AMH水平与IVF结局之间的相关性, 但排除PCOS患者对剩余不孕患者进行分析发现, 血清及卵泡液AMH水平与AFC、获卵数、受精率及优质胚胎数间均呈显著正相关。

目前, 对于行ART的患者, 评估卵巢储备的定量检查仅局限于对周期卵母细胞数量的分析, 而DOR可能是通过降低卵母细胞的数量及质量, 进而影响胚胎的数量及质量, 从而使临床妊娠率降低。由于目前尚无有效的方法评估卵母细胞的质量, 仅能通过对受精率、优质胚胎数、临床妊娠率及活产率进行分析。因此, AMH作为术前评估IVF结局的预测指标有待进一步探讨。
2.5 用AMH评估肿瘤患者、子宫内膜异位症（endometriosis, EMs）患者生育能力

对AMH的研究初期仅局限于生殖内分泌阶段, 如今, AMH的研究已拓宽至肿瘤领域, 特别是育龄期肿瘤患者生育力的评估。有研究追踪调查儿童期肿瘤患者发现, 肿瘤人群的不孕比例也较健康同龄人高, 且人群AMH水平明显低于健康同龄人。对接受新辅助化疗的育龄期乳腺癌患者的多中心前瞻性队列研究分析显示, 患者血清AMH水平较化疗前均明显降低, 但化疗前血清AMH水平较高者, 其化疗结束后1年卵巢功能改善较明显, 且后续伴随较好的生育能力。此外, 还有学者基于动物实验研究提出, 对单一化疗药物, 小鼠血清AMH水平及睾丸质量呈现同等程度的下降趋势, 这对临床指导生育期男性生殖系统肿瘤患者选择化疗方案、评估放化疗后男性生育力也起着一定作用。

此外, 也有研究对EMs患者术前、术后血清AMH水平进行随访发现, 双卵巢型子宫内膜异位囊肿较单侧型子宫内膜异位囊肿患者术前血清AMH水平低, 且无论何种类型的子宫内膜异位囊肿, 其囊肿剥除术后血清AMH水平较前均进一步降低。这提示对于有生育要求的EMs患者, 术前有必要评估患者的卵巢储备功能, 衡量手术及ART治疗的利弊, 避免术后出现严重的DOR甚至POF。
2.6 AMH与肿瘤

卵巢颗粒细胞瘤（GCT）主要分泌雌激素,约占卵巢肿瘤的3%~5%,分幼年型和成人型两种。AMH可作为GCT的标志物之一。既往研究结果提示在卵巢成人型和幼年型GCT中AMH有表达,并且卵巢GCT的肿瘤大小及分化程度与患者体内血清AMH水平正相关,AMH越高,卵巢肿瘤体积越大,在高、中分化组AMH的阳性表达率明显高于低分化组。Decoudier等报道了1例41岁继发性闭经和不孕的患者,认为AMH对诊断GCT有意义。AMH可抑制肿瘤细胞的生长,敲除AMHRⅡ的小鼠,出生后易患睾丸间质肿瘤。超过65岁的绝经期女性体内几乎检测不到AMH,故AMH可作为筛查绝经后女性GCT的指标。

视频1 通过AMH测定了解化疗对卵巢储备功能的影响
三、卵巢早衰与卵巢储备功能低下

卵巢早衰（POF）是指卵巢功能衰竭所导致的40岁之前即闭经的现象。特点是原发或继发闭经伴随血促性腺激素水平升高和雌激素水平降低，并伴有不同程度的一系列低雌激素症状如：潮热多汗、面部潮红、性欲低下等。妇女的平均自然绝经年龄为50～52，绝经年龄存在着种族和地区分布的差异，但其绝对值相差不大。Coulam等总结1858例妇女的自然闭经情况，小于40岁的POF发生率为1%，小于30岁的POF发生率为1‰。原发闭经中POF占10%～28%，继发闭经中POF占4%～18%。徐苓等发现北京地区妇女POF发生率为1.8%。由此可见，POF在临床上并不少见。

卵巢储备功能反映卵巢皮质区卵泡生长发育形成优质卵母细胞的能力, 指的是卵巢内存留卵泡的数量和质量,反映了女性的生育潜能。卵巢储备功能下降（decreased ovarian reserve , DOR ）是指卵巢产生优质卵母细胞的能力减弱,导致生育能力下降,同时伴随性激素的异常。 DOR约占不孕症的10%, 且呈现不断上升趋势, 严重影响着广大妇女的生殖健康和生活质量,若不及时治疗,可进一步发展为卵巢早衰（premature ovarian failure, POF）。目前,关于DOR的定义,国内外尚未达成共识[36,37], 临床多采用10 IU / L < b FSH < 40 IU / L水平, 结合B超及其他血清学检查评估卵巢储备功能,辅助诊断。
3.1 病因研究
3.1.1 遗传因素

本病的遗传学异常包括X染色体异常、常染色体异常及基因突变,其中主要是X染色体异常,约占93.7%,包括部分缺失、倒位及易位等,均可影响卵母细胞的生长、发育和成熟;另一方面,随着年龄增长,线粒体DNA突变、端粒酶活性下降与端粒缩短等累积性损伤,也将影响卵泡的数量与质量。
3.1.2 卵巢破坏性因素

卵巢破坏性因素包括卵巢手术史（包括输卵管切除、巧克力囊肿剥除术、子宫肌瘤剜除术、卵巢打孔术等）、放化疗史、盆腔感染等。其对卵巢的损伤机制可能主要为破坏卵巢血供及损害卵母细胞、导致卵巢间质纤维化或坏死等[40,41]。
3.1.3 免疫因素

有研究提示,DOR患者存在多种自身免疫性抗体（如抗卵巢抗体、抗核抗体、抗透明带抗体、抗心磷脂抗体等）或伴有自身免疫性疾病（如桥本甲状腺炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等）。卵巢的自身免疫反应可破坏卵巢,导致成熟前卵泡闭锁,卵子退化。
3.1.4 感染因素

在儿童期或青春期患流行性腮腺炎常可合并病毒性卵巢炎,导致卵巢功能部分或全部丧失,造成卵巢储备功能下降甚至POF的发生。此外,痢疾杆菌、麻疹病毒、巨细胞病毒感染以及严重的结核性、淋菌性或化脓性盆腔炎等亦可破坏卵巢组织,造成卵巢功能的减退。
3.1.5 环境、社会心理和生活方式的因素

如环境污染、环境毒物、不良生活作息习惯及工作压力等。长期紧张、焦虑、抑郁的不良精神刺激状态亦容易诱发中枢神经系统以及下丘脑-垂体-性腺轴分泌异常,导致DOR。
3.1.6 其他因素

有研究指出女性初潮年龄与卵巢储备相关,晚初潮女性较早初潮者DOR风险下降,为DOR的保护因素。此外,受教育程度高、婚姻家庭状况差、多次流产、生化妊娠、不恰当的避孕措施、慢性疾病等均可导致DOR。随着辅助生殖技术的发展,有研究表明过多或不规范的促排卵治疗或取卵手术和患者的卵巢储备功能之间存在负相关,患者的卵巢储备功能随着接受采卵手术的次数的增加而不断下降,但尚不能完全排除年龄因素的影响。
3.2 预测指标

预测卵巢储备功能的指标有很多, 没有哪一项指标具有绝对的灵敏度和特异性, 参考多个指标可获得预测卵巢储备和反应的更好证据。另外需要说明的是, 偶尔的一次评估提示DOR,不能说明患者未来受孕能力低下,因为卵巢储备能力处于动态变化中。
3.2.1 年龄

年龄与卵巢储备功能密切相关,也是预测卵巢储备功能、评估卵子质量的重要指标之一。虽然卵巢功能是随着年龄逐渐下降,但是在32岁以后加速,尤其在37岁以后,储备功能急速下降。对于35岁以上女性,有专家建议,如果积极试孕超过6个月仍未获妊娠,需要就诊以寻求治疗。即使患者生物年龄相同,卵巢的生殖年龄也会存在很大的个体差异,因为个体之间胚胎发育时期卵泡池大小、卵泡发育水平或者闭锁速度不一,此外卵巢生殖年龄还受遗传、环境、卵巢手术史等多因素影响。因此,生理年龄只能作为预测卵巢储备功能的一项粗略指标,生理年龄结合生殖年龄才能够真正反映卵巢储备功能和反应性。
3.2.2 性激素

（1）卵泡雌激素（follicle stimulate hormone ,FSH）: 垂体在下丘脑促腺激素释放激素（gonadofropinreleasing hormone,Gn RH）的刺激下, 释放FSH, 同时受雌二醇（E2）和血清抑制素B（INH-B）的负反馈调节。随着FSH升高,会导致卵泡募集提前,E2升高,月经周期缩短。对于妇产科医生来说, 临床最切实可行的评估卵巢储备功能的指标即为血清基础FSH,可反应DOR的程度,一般以月经来潮第2 ~ 3 天测定的FSH值来评估卵巢储备功能, 但是变异性比较大,只能是粗略估计,没有确切的阈值范围,具有自身局限性。一般国内理想水平低于10 IU / L, 超过10IU / L即提示卵巢功能异常。但是仅一次FSH检查, 不具有预测价值;仅FSH的升高,可提示IVF周期较低的获卵率,但是不具有预测妊娠率的价值。（2）E2: 一般在卵泡早期低于50 pg / mL,早卵泡期升高（60 ~ 80 pg / mL）提示卵泡募集提前,介于E2对FSH的负反馈,在DOR早期,FSH可维持在正常水平, 故结合基础E2能减少基础FSH评估的假阴性率。但雌激素水平单独预测价值较低。因为E2易受卵巢囊肿、月经周期、激素药物等因素影响,波动较大,临床单独运用E2预测价值有限,需结合其他指标,综合评估卵巢功能（3）抗苗勒管激素（antimullerian hormone ,AMH）: 主要是初级卵泡、窦前卵泡、窦卵泡的颗粒细胞分泌的糖蛋白,可以反映原始卵泡池的储备。由于早期卵泡分泌AMH不受FSH的调节, 故在整个月经周期,AMH呈相对稳定状态, 这意味着可将AMH作为一种不依赖于月经周期的预测卵巢反应的标志物, 在临床上应用起来比其他卵巢储备标志物更方便, 且不受激素类药物的影响,可以预测IVF-ET的妊娠结局及卵巢对Gn的反应能力,低水平的AMH预示卵巢反应不良。随着年龄增长,AMH水平下降,可以反应卵巢储备,并且AMH的下降,早于FSH的升高,具有更佳的预测价值[54,55]。但是由于不同厂家试剂框检测方法不同,各学者报道数值差别比较大（4）INH-B:主要由窦前卵泡和窦卵泡分泌的一种糖蛋白物质。随着年龄增长,卵巢储备下降,INH-B水平降低。 INH-B对FSH具有抑制作用,故INH-B下降可以导致FSH升高,故INH-B下降先于FSH升高。但是,这一项指标在月经周期中波动比较大,故INH-B不能准确的预测卵巢储备功能,因此不作为常规推荐。
3.2.3 B超:窦卵泡数（AFC）及卵巢体积

（1）AFC : 月经第2 ~ 5 天经阴道B超下, 可以直观的计数直径在2 ~ 10 mm的卵泡的数。窦卵泡的数量反映卵巢储备和IVF周期卵巢的反应性, 如果双侧AFC在3 ~ 6 个之间则预示IVF周期卵巢低反应及较低的获卵率。临床运用AFC预测卵巢储备具有准确性高、成本低、实用性高等优点,其预测价值优于b FSH,与AMH相当,是评估卵巢储备功能和反应性的最佳单一指标。建议可将其作为卵巢储备和反应性评价的首选指标。但B超操作具有一定主观性, 检查结果的准确性受检查者的操作水平、测量的标准、测量仪器等因素影响,故对AFC的准确测定是其临床应用的一个关键（2）卵巢体积:计算公式为0.52 × 长 × 宽 × 高,即不同切面角度卵巢的3 个径线值。随着年龄增长, 卵泡储备降低, 卵巢体积会下降。尽管卵巢体积能预测卵巢储备和反应性,但不能够预测卵子质量。因此, 在临床应用中不适用于预测临床妊娠率。
3.2.4 其他

其他因素还包括遗传或获得性疾病, 如Turner综合征等;既往的盆腔炎、卵巢囊肿手术史、放化疗史、慢性病史等。中医体质学说认为本病患者常见人格为气郁质,其次为血瘀质,亦可为临床预测提供一定参考价值。

视频2 梁丽《AMH检测的临床应用》
四、多囊卵巢综合征

多囊卵巢综合征（ploycystic ovary syndrome, PCOS）是女性最常见的生殖内分泌紊乱性疾病, 育龄期女性发病率为5%~10%。本病诊断主要根据Rotterdam诊断标准:稀发排卵或无排卵、有高雄激素的临床表现和（或）高雄激素血症、卵巢多囊改变, 3项中至少满足2项并排除其他导致高雄激素的病因。PCOS常见的临床表现为月经紊乱、肥胖、多毛、痤疮、不孕、胰岛素抵抗（IR） , 并可伴有呼吸暂停、抑郁症、子宫内膜癌及心血管疾病等一系列并发症。目前研究表明, PCOS与下丘脑-垂体-性腺轴的异常、卵巢相关酶的缺陷、各种内分泌代谢紊乱等显著相关, 但其具体发病机制仍不清楚。抗缪勒管激素（anti-mullerian hormone, AMH）是由女性卵泡颗粒细胞和男性睾丸支持细胞分泌的二聚体糖蛋白, 是转化生长因子β （TGF-β）超家族中的一员。AMH参与卵泡异常发育及排卵障碍, 在PCOS患者中的表达是正常人的2~3倍。此外, Pellatt等研究表明, 与正常卵巢的颗粒细胞相比, PCOS患者每个颗粒细胞分泌的AMH量平均增加了75倍。
4.1 多囊卵巢的发病机制
4.1.1 胰岛素抵抗（IR）

近年来, IR被认为是PCOS发病中的核心环节, 且其可能在PCOS发病早期起关键性作用。胰岛素通过自身胰岛素样生长因子刺激体内雄激素的分泌, 且胰岛素水平升高会刺激垂体合成过多的促黄体生成激素（LH） , LH又作用于卵巢的卵泡膜细胞, 促使其生成更多的雄激素, 进而使机体出现高雄激素血症, 导致排卵障碍及糖脂代谢紊乱。同时促黄体生成激素/卵泡刺激素（LH/FSH）比例失调会导致卵巢基础卵泡过早黄素化, 提前闭锁, 优势卵泡发育受阻, 卵泡不能正常发育成熟并排卵, 从而形成典型的卵巢多囊改变。雄激素升高可加速卵巢基质的增生进而加速卵泡的闭锁, 降低葡萄糖载体蛋白效能, 直接诱导IR产生。综上所述, IR在PCOS的发病中处于中心环节, 并且IR与高雄激素血症相互作用共同导致PCOS的发生发展, 形成恶性循环, 因而改善IR及高雄激素血症是治疗PCOS的关键[66,67]。

此外, 高胰岛素及高雄激素血症可诱发PCOS患者体内脂肪堆积, 且主要集中堆积在腹部及内脏, 而堆积的脂肪可降低血清中性激素结合球蛋白水平, 使结合的雄激素减少, 游离睾酮水平升高, 同时这些脂肪还可使机体内雌酮水平增加, 但这种雌激素的产生无周期性, 会加重患者的月经紊乱, 甚至导致无排卵性不孕。

有学者指出, PCOS患者无论是否合并肥胖都存在不同程度的IR。当IR现象存在于卵巢组织中时, 可导致机体甾体激素的合成异常及糖代谢异常, 最终导致PCOS的发生。研究认为, PCOS也是一种以IR为特征的慢性代谢障碍性疾病, IR和高胰岛素血症在PCOS的发病中起着非常重要的作用。因此, 如何改善PCOS患者IR, 增加胰岛素敏感性在相关领域研究中日益受到重视。
4.1.2 高尿酸血症

有研究表明, 高尿酸血症与IR、高胰岛素血症以及糖脂代谢紊乱关系密切, IR可促进高尿酸血症的发生、发展, 而高尿酸血症又是IR的孤立危险因素。高海杰等的研究显示, IR组研究对象的空腹胰岛素、空腹血糖以及尿酸水平明显高于非胰岛素抵抗（NIR）组（P<0.05） , 且研究对象体质指数、空腹胰岛素、空腹血糖及尿酸与胰岛素抵抗指数（HOMA-IR, 常用来评判IR水平, HOMA-IR=空腹胰岛素×空腹血糖/22.5）呈正相关（相关系数r值分别为0.48, 0.95, 0.25及0.42, P<0.05）。因胰岛素可促进肾脏对尿酸的重吸收, 进而导致血尿酸水平升高, 由此可引发高尿酸血症;另外, 高胰岛素血症患者体内三磷酸甘油醛脱氢酶的活性降低, 从而导致机体可产生更多的尿酸和甘油三脂。还有相关证据显示, 一氧化氮（NO）参与胰岛素调节下的葡萄糖利用过程, 然而尿酸可通过阻碍NO的作用进而加重IR。因此, 控制尿酸水平、改善IR、控制血糖水平对改善PCOS患者的糖脂代谢有非常显著的作用。
4.1.3 血清瘦素水平过高

瘦素是肥胖基因的表达产物, 其可直接参与卵巢功能的调节。血清瘦素与胰岛素、雄激素可相互作用, 共同参与机体糖脂代谢的调节, 此外, 血清瘦素还与血透明质酸（HA）、胰岛素一起参与PCOS的发生。高水平的血清瘦素可抑制下丘脑神经肽Y的合成和释放, 增强下丘脑GnRH神经元的活动以及垂体对GnRH的反应, 最终导致垂体分泌FSH不足, LH/FSH比例上升。因此, 异常的血清瘦素水平也是PCOS的临床特征之一。
4.1.4 抗苗勒管激素异常分泌

抗苗勒管激素（AMH）是由卵巢的窦卵泡分泌的一种特殊类型糖蛋白, 主要作用为抑制卵泡生长, 增加卵巢基础卵泡数量。PCOS患者常表现为AMH分泌过多, 其AMH水平是正常人群的2~3倍, 故临床上常通过AMH水平判断卵泡发育程度, 由此推断AMH过度分泌可能为PCOS又一重要发病机理。李轶等的研究表明, 高雄激素组PCOS患者的AMH水平明显高于非高雄激素组PCOS患者（P<0.05） ;另外, AMH诊断高雄激素组PCOS患者的敏感性（82%）明显高于非高雄激素组（64%） , 由此可以看出PCOS不仅存在不同的亚型, 而且不同亚型彼此之间的发病机制存在差异。雄激素过高可促使基础卵泡分泌过多的AMH, 而后者可抑制卵泡的发育成熟, 导致基础卵泡增多并且出现卵巢体积增大并多囊样改变, 因此推测这可能是AMH异常分泌导致PCOS发病的机制之一。
4.2 AMH与PCOS的病理生理
4.2.1 AMH与卵泡异常发育及排卵障碍

研究表明, AMH及其受体在窦前卵泡和直径<4 mm的小窦状卵泡中表达最高, 而在4~8 mm的窦状卵泡中表达逐渐降低, 在直径>8 mm的卵泡中几乎不表达。AMH可能参与了卵泡发生的两个关键性步骤:第一步称为初始募集, AMH可能抑制始基卵泡的起始募集, 阻止其进入生长卵泡池;第二步称为周期性募集, AMH可能通过降低卵泡对促卵泡激素（FSH）的敏感性抑制窦前卵泡和小窦状卵泡生长至排卵前阶段, 最终导致卵泡发育停滞及排卵障碍。但是, AMH具体的分子作用机制仍不十分清楚, 可能原因为AMH调节其他细胞因子的基因转录, 以保持处于被捕状态的原始卵泡。
4.2.2 AMH与FSH

研究证实, FSH可抑制AMH启动子荧光素酶的活性, 并且抑制PCOS患者卵巢颗粒细胞过度表达和分泌AMH, 从而促进卵泡正常发育。从这点上说明了AMH与FSH呈负相关。目前研究表明, AMH与FSH在PCOS中的作用:（1） AMH可以抑制FSH受体mRNA的表达, 可能影响卵泡对FSH的敏感性, 从而抑制FSH刺激卵泡生长, 阻碍了优势卵泡的选择, 使小窦状卵泡的发育停滞。而FSH对小卵泡的调节受损, 使PCOS患者颗粒细胞持续产生高水平的AMH（2）高水平的AMH抑制了FSH受体mRNA的表达, 使得有活性的FSH呈持续低浓度, 进而刺激卵泡生长发育为窦状卵泡, 优势卵泡选择受阻, 形成了卵巢多囊形态（polycystic ovarian morphology, PCOM）（3） AMH属于TGF-β超家族中的一员, 研究表明TGF-β作为芳香化酶CYP19基因的反式作用因子, 可以抑制FSH依赖的芳香化酶的表达, 使雄激素转化受阻。
4.2.3 AMH与黄体生成素（LH）

正常女性中, 适量的LH能促使雄激素生成, 进而促使卵泡募集的数量增多, 增强颗粒细胞对FSH的敏感性, 抑制卵泡分化后期抗缪勒管激素Ⅱ型受体（AMHR-Ⅱ）的表达, 降低AMH的敏感性, 从而促进早期卵泡发育、晚期卵泡成熟及排卵。在PCOS患者中, FSH水平低或正常, 但由于患者下丘脑促性腺激素释放激素（GnRH）脉冲频率增加, 基线水平和受刺激的LH浓度更高, 导致LH/FSH比值升高。有文献报道, PCOS患者LH和LH/FSH比值升高时, 存在不同程度的排卵障碍。而体外培养研究显示, 在PCOS患者颗粒细胞培养基中加入LH后, AMH增加了4倍。上述研究均提示PCOS患者排卵障碍与循环AMH浓度呈正相关。且过高的LH和LH/FSH比值促进卵泡膜细胞和间质细胞生成过多的雄激素, 排卵前循环中的睾酮（T）过多又可促进非优势卵泡闭锁。因此, 过高的LH可能对雄激素刺激颗粒细胞产生AMH起协同作用, 并可抑制卵泡成熟, 影响排卵。
4.2.4 AMH与雄激素

高雄激素是PCOS患者常见的内分泌特征, 可使患者表现出多毛、痤疮、脱发等一系列男性化特征, 严重危害女性身心健康。有研究表明, 在PCOS和非PCOS女性的颗粒细胞中, 雄激素受体（AR）的表达与AMH呈正相关, 雄激素与血清AMH浓度孤立相关。Pierre等研究表明, PCOS组总T、游离T和5α-双氢睾酮水平显著高于正常对照组。也有研究者发现, PCOS患者AMH水平与T不相关。AMH能够抑制FSH依赖的芳香化酶（CYP）表达, 进一步抑制雄激素转化, 这可能是高雄激素形成的最主要因素。有研究者认为, 高雄激素可导致卵泡颗粒细胞的增生, 所以增加了AMH的合成。一项动物模型实验结论与之相反, 此实验发现老鼠宫内暴露过量的T, 可以减少生物合成和循环AMH浓度。所以, 雄激素与AMH之间相互作用的具体机制, 还待进一步探讨。PCOS女性颗粒细胞中AMH和AMHR2表达的调节改变了AMH/AMHR2系统的过度表达, 并可能导致这些患者的滤泡发育停滞。过高的AMH可能协同过量的雄激素使大量小窦状卵泡堆积, 形成PCOM, 最终导致患者排卵障碍的发生。
4.2.5 AMH与雌激素

足量的雌激素可以维持卵泡继续发育, 避免卵泡闭锁。许多临床研究也发现血清AMH与雌激素呈负相关[23,24], 但也有研究显示二者无明显的相关性。在PCOS患者中, 升高的AMH通过抑制FSH依赖的芳香化酶的表达, 使得雄激素向雌激素转化受阻, 形成了低雌激素状态以及高雄激素状态。而高水平的雄激素在外周组织转化成雌酮（E1）后, 使循环中E1/雌二醇比例升高, 反馈性增加垂体对GnRH的敏感性, LH合成增加, 使卵泡发育滞缓甚至闭锁。而雌激素水平的下降, 可能进一步导致优势卵泡选择困难。AMH的升高可能破坏了正常卵泡发育, 阻碍卵泡成熟。因此, PCOS患者高AMH水平与低雌激素水平可能共同作用于卵泡, 最终致卵泡发育受阻、排卵障碍。
4.2.6 AMH与肥胖

目前PCOS患者中AMH水平与体重指数（BMI）的关系存在较大争议。研究表明, AMH、AMHR-Ⅱ的表达与BMI呈负相关。而临床研究也证实, PCOS患者中非肥胖组AMH水平明显高于肥胖组。一项国外研究表明, 通过口服奥司利他（120 mg每日3次）、限制热量或控制饮食、体育锻炼减重治疗, PCOS患者AMH水平较前升高。但也有研究表明, PCOS患者AMH水平与BMI呈正相关。Thomson等研究显示, 对于超重或肥胖的PCOS女性, 20周的减重干预导致生殖功能改善, 但未改变AMH水平。部分研究也同样支持PCOS患者AMH水平与BMI无明显相关性。
4.2.7 AMH与IR

虽有研究显示, PCOS患者AMH水平与IR无关或呈负相关, 但多数研究显示PCOS患者AMH水平与IR程度相关, 且AMH与空腹胰岛素水平以及胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）呈正相关[31,32]。研究者发现, 二甲双胍治疗后, PCOS患者的AMH水平显著下降;低热量饮食在使PCOS患者BMI显著下降的同时, 胰岛素水平也下降。目前AMH与IR之间的具体作用机制仍不清楚。已有研究表明, 胰岛素除了能直接促使PCOS患者卵泡膜细胞产生雌激素外, 还能通过刺激卵泡膜细胞增强雄激素合成限速酶P450c17a的活性, 导致卵泡异常。由此推测, 胰岛素可能会使对其敏感的颗粒细胞产生过多的AMH。AMH抑制了雄激素转化, 卵泡内高雄激素环境使颗粒细胞产生更多的AMH, AMH再阻碍雄激素转化, 这样AMH与高雄激素之间形成恶性循环。
4.2.8 AMH与遗传变异

近年研究发现, AMH及AMHR2的基因多态性可能在PCOS发病过程中起重要作用。Alice等发现, 在PCOS患者的颗粒细胞（GCs）中, AMH和AMHR2表达的调控方式发生了改变, 促进AMH/AMHR2系统的过度表达, 致其发生卵泡阻滞。另有研究发现, 伴IR的PCOS组患者与健康对照组中的AMH基因多态性存在显著差异, AMH信号通路中的基因多样性可能与PCOS的易感性和胰岛素抵抗有关。Lidija等则提出, PCOS患者体内编码AMH的基因存在潜在的有害变异, AMH变异体通过降低AMH介导的CYP17活性的抑制来增加雄激素的生物合成。但也有Me Ta分析显示, AMH和AMHR2的遗传变异似乎并未给PCOS带来更高的风险, 未发现AMH或AMHR2的基因变体与PCOS高危风险相关。目前可以肯定的是AMH/AMHR2系统的异常表达确实与排卵障碍有关, 而AMH/AMHR2系统表达异常可能受遗传变异或糖代谢异常等环境因素的影响。此外, 国外有研究显示, PCOS患者青春期女儿的AMH水平每增加1ng/mL, 未来发生PCOS的优势比增加1.27倍, 遗传易感女孩发生PCOS的风险可能与AMH水平的升高有关。
4.3 AMH、PCOS与年龄

PCOS患者随年龄的增加可能会逐渐自愈。数据显示, 至少50%的无排卵PCOS患者在他们晚期生殖年龄中会恢复排卵。李轶等研究发现35岁以后PCOS的发生率显著下降, 临床妊娠率略有升高, 这可能与高龄PCOS患者的卵巢储备功能相对更好有关。而AMH是衡量女性卵巢储备功能的一个有效指标, 正常女性的AMH水平随年龄增长而降低, 年龄分层的阈值可能比基于总体人群的阈值更准确地预测了PCOS。金婧等针对PCOS合并卵巢储备功能下降（DOR）这一类特殊群体展开了一系列研究, 结果显示, 年龄与AMH没有明显的负相关关系, 这一群体的内分泌特征与单纯PCOS或单纯DOR患者均不同。他们还发现AMH预测PCOS合并DOR的临界值为2.53ng/mL, 高于既往研究报道的用于诊断单纯DOR的AMH临界值（0.5～1.1ng/mL）。长期随访PCOS患者未来的临床表现与卵巢储备功能的变化可能是值得今后深入研究的一个方向。
4.4 AMH与PCOS的诊断

一项关于韩国年轻女性的研究显示, AMH诊断PCOS的最佳界定值为10 ng/ml。在印度尼西亚妇女中, 以AMH为4.45 ng/ml作为诊断PCOS的界定值, 诊断敏感性为76.1%、特异性为74.6%。一项关于澳大利亚女性的研究显示, 血清AMH值为5 ng/ml是诊断PCOS的最佳界定值, 诊断敏感性为84%、特异性为82%。Sathyapalan等针对西班牙女性的研究显示, 以AMH=6.44 ng/ml为界定值诊断PCOS的曲线下面积（ROC）为0.76, 诊断敏感性为41%、特异性为86%, 当以AMH=4.90 ng/ml为界定值诊断PCOS的敏感性为55%、特异性为79%。由此可见, 种族差异可能会影响AMH诊断PCOS的结果, 也不能排除由于测量方法不同、样本量和入选对象的不同造成AMH界定值差异所致可能。当以AMH=6.99 ng/ml为PCOS诊断界定值时, ROC为0.926, 诊断敏感性为84%、特异性为92%, 诊断效能较高。以AMH=3.92 ng/ml为界定值, 诊断PCOS的敏感性为65%、特异性为62%。以AMH=8.4 ng/ml为界定值, AMH诊断PCOS的AUC为0.875（95%CI:0.831, 0.916） , 诊断敏感性为73.5%、特异性为91.5%。可见, 不同的PCOS诊断界定值可影响AMH的诊断效能。

Quinn等以卵巢早衰患者作为对照组, 结果显示以AMH=55.36 pmol/L（≈7.75 ng/ml）为区分PCOS与卵巢早衰的最佳界定值, 诊断敏感性为82%、特异性为78%, 当按年龄分组时, 最佳的AMH界定值随着年龄的增长而下降。一项针对PCOS同时伴有卵巢储备功能减退（diminished ovarian reserve, DOR）的中国妇女的研究显示, 以AMH=2.53 ng/ml为界定值诊断此类患者的ROC为0.932, 诊断敏感性为92.5%、特异性为73.7%。所以, 无论是区分PCOS与卵巢早衰, 还是确诊PCOS合并DOR, AMH均有着较高的诊断效能。

研究表明, 以AMH=29 pmol/L（≈4.06 ng/ml）为界定值可以用来区分有无PCOM, 而以AMH=45 pmol/L（≈6.30 ng/ml）为界定值可用来区分孤立的PCOM和PCOS患者, 且AMH值越高, 其表型越明显, 因此需要使用不同的界定值来区分PCOM、高雄激素血症和排卵障碍。提示AMH或许可以取代经阴道超声检查来评估PCOM, 而且可以进一步判断PCOS的严重程度。因AMH检测时间不受月经周期的影响, 可提高PCOS诊断的简便性, 避免了B超下卵泡计数和卵巢体积计算的人为干扰, 更适合在临床推广。

也有少数研究认为, AMH单独诊断PCOS的效能较低, 而AMH、B超及T联合检测诊断PCOS的敏感性及特异性均较高。以AMH≥35 pmol/L（≈4.90 ng/ml）为界定值, AMH单独诊断PCOS的敏感性为54%, 特异性为50%;AMH联合T诊断P-COS的敏感性为70%, 特异性63%;而三者联合检测诊断PCOS的敏感性为82%, 特异性为81%。据此分析, 对于临床症状不典型的PCOS患者, AMH联合其他指标检测可提高诊断率。

综上, AMH与PCOS的发生发展有密切联系, 且对于诊断PCOS具有较高的临床价值。目前尚无统一诊断PCOS的AMH界定值标准, 未来需要更具代表性的前瞻性大样本量临床研究帮助制定不同种族的AMH界定值, 也需要更深入的基础实验研究, 从细胞、基因水平探讨AMH的确切作用机制。

五、卵巢过度刺激综合征

卵巢过度刺激综合征（OHSS）是体外受精-胚胎移植（IVF-ET）过程应用促排卵药物所导致的并发症, 不仅影响胚胎发育和妊娠率, 严重可危及患者生命。OHSS分为早发型和晚发型两种, 早发型OHSS发生于取卵后9d内, 晚发型于取卵10d后发生。在行IVF治疗患者中, 中重度OHSS发生率为2%~3%, 轻度OHSS发生率可达20%~30% 。关于OHSS的发病机制尚不明确, 因此在积极探寻有效预防和治疗方法的同时, 明确其发病机制是关键。
5.1 OHSS发生的病理生理机制

OHSS的可能机制目前认为是由于某些因子, 如血管内皮生长因子（VEGF）、血管紧张素2、炎症因子和其他细胞因子等导致血管通透性增加, 液体从血管内转移到第三腔隙, 表现为卵巢体积增大、腹水、胸水、心包积液;低血容量引起的少尿、血液浓缩导致血栓形成, 严重可引起肾衰、急性呼吸窘迫综合征, 甚至导致死亡。
5.2 血管内皮生长因子

McClure等将OHSS患者的腹水与重组VEGF抗体在体外培养后, 其增加血管通透性的作用显著降低, 表明VEGF可能是引起血管通透性增加的主要原因。VEGF作用于血管内皮细胞的VEGF受体-2（VEGF-2）使其磷酸化, 进而调控两类连接蛋白, 包括血管内皮钙黏蛋白（VE-Cadherin）、紧密连接蛋白Nectin 2及Claudin 5 。通过小干扰RNA（siRNA）分别抑制3种蛋白的mRNA翻译均会使血管通透性增高;升高的VEGF则抑制这3种连接蛋白的表达, 从而使内皮细胞间连接变松散, 血管通透性增加;3种蛋白也会通过相互影响实现其对血管通透性的调控。体外实验表明, 分别下调VE-Cadherin和Claudin 5不但会抑制彼此表达, 也会减少Nectin 2的表达。VEGF对于以上3种蛋白调控的机制尚不明确, 其具体的分子调控靶点及信号通路尚需进一步研究。目前认为VEGF是引起OHSS患者血管通透性增加的主要因子, 溴隐亭和卡麦角林均是麦角衍生物类多巴胺受体激动剂（DRa） , 国内外学者研究表明其可以降低中重度OHSS的发病率, 机制是DRa结合VEGFR-2, 抑制其磷酸化, 拮抗其活性, 从而阻断了VEGF信号通路, 导致血管生成减少, 血管通透性降低[6,7] 。促性腺激素释放激素（GnRH）拮抗剂醋酸西曲瑞克也可减少中重度OHSS发生率, 具体作用机制可能是通过抑制颗粒细胞表面的GnRH受体, 进而减少颗粒细胞VEGF产生, 从而发挥预防OHSS的作用。
5.3 绒毛膜促性腺激素（hCG）作用

传统观点认为是VEGF是OHSS发生的基础, 内外源性的hCG均可增加黄素化颗粒细胞表达VEGF, 尤其是卵巢高反应的患者增加更为明显, 注射hCG后卵泡液及外周血中VEGF水平迅速升高, 48h达高峰, 因此现在普遍接受的OHSS发生的病理生理机制就是hCG作用于颗粒细胞促进VEGF表达, 从而导致血管通透性的增加。hCG调控黄素化颗粒细胞VEGF表达主要通过环磷腺苷/蛋白激酶A/缺氧诱导因子1α（cAMP/PKA/HIF-1α） , 磷酸酯酶C/蛋白激酶C/刺激蛋白1（PLC/PKC/Sp1）和环磷腺苷/蛋白激酶A/环磷腺苷效应元件结合蛋白（cAMP/PKA/CREB）通路。缺氧诱导因子（HIF）在多种组织细胞中被证实能够促进VEGF的表达, 在缺氧条件下, HIF-1α结合于VEGF基因启动子区5'侧翼的缺氧反应元件区域, 引起VEGF表达升高, 在非缺氧条件下, hCG能够刺激体外培养的人黄素化颗粒细胞, 使其HIF-1α以及VEGF表达均增加 , 这说明hCG可以通过缺氧诱导因子作用促进VEGF表达。另外两条通路也被证实可以增加颗粒细胞中的VEGF表达, hCG作用于颗粒细胞的LH/hCG受体, 激活第二信使PLC以及cAMP, 两者分别通过PKC和PKA使其活化, 通过一系列级联反应, 磷酸化转录调控因子Sp1和CREB, 从而促进VEGF表达, 而磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt） , 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族中的p38丝裂原活化蛋白激酶通路, 细胞外调节蛋白激酶ERK通路, c-Jun氨基末端激酶JNK通路并不参与hCG对于VEGF表达的调控。hCG是诱发OHSS的关键因素, 高危患者使用GnRH激动剂代替hCG诱发排卵, 或者全胚冷冻均可减少OHSS发生。
5.4 内质网应激

内质网应激是非折叠或者错误折叠的蛋白质累积于内质网, 诱发非折叠蛋白质反应（UPR） , 缺血低氧、葡萄糖或营养物匮乏、炎性因子等因素可引发内质网应激。蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）、内质网核信号转导蛋白1（IRE-1）、活化转录因子6（ATF6）是UPR的三条信号通路的重要分子, 通过自身磷酸化而激活, 其中PERK轴的激活会导致活化转录因子4 （ATF4）表达增加;激活的核酸内切酶Ire1能从X框结合蛋白XBP-1mRNA中特异性剪切26个碱基的内含子, 改变XBP-1mRNA的开放解读码组, 其翻译产物为一种功能性XBP-1转录因子;而活化的ATF6从内质网释放, 通过高尔基体的裂解, 其N末端片段转运入核, 与内质网应激反应元件结合, 促进相关基因表达。三条通路中的最终转录因子ATF4、XBP-1剪接体、经裂解的ATF6均可以结合到基因的启动子区, 从而促进VEGF表达。研究表明, 超促排卵会引起颗粒细胞内质网应激, 发生OHSS患者的卵丘颗粒细胞中XBP1（S）以及VEGF的表达明显高于非OHSS患者, XBP1（S）与VEGF的表达呈显著正相关, XBP1的表达还与获卵数呈正相关。内质网应激诱导剂衣霉素刺激体外培养的人黄素化颗粒细胞可显著升高XBP1（S）以及VEGF的表达, 而加入牛磺熊去氧胆酸（TUDCA） , 一种内质网应激的抑制剂, 可抵消衣霉素的作用;此外OHSS模型小鼠注射TUD-CA可显著降低其血管通透性以及卵巢的VEGF表达。这些结果均提示, 内质网应激可能参与OHSS发病机制。TUDCA临床上用于治疗胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎、原发胆汁性肝硬化等疾病, 而TUDCA是否可用于预防OHSS尚需进一步临床研究证实。
5.5 阿片肽受体信号通路

研究显示, 在视网膜上皮及皮肤微血管内皮阿片肽受体与丝裂原激活的蛋白激酶信号通路相偶联, 激活阿片肽受体OPRM1可增加c-fos以及junB的表达, 进而使激活蛋白复合物1的数量增多, 而基因的启动子区存在有该复合物的结合位点。Beata等发现人卵巢颗粒细胞有阿片肽受体OPRM1的存在, 激动该受体可促进黄素化颗粒细胞以及COV434颗粒细胞系表达VEGF;反之, OPRM1拮抗剂纳洛酮可抑制VEGF表达。以往研究也发现卵泡液中的OPRM1的配体β内啡肽水平在排卵前显著增高 , 这些均提示卵巢颗粒细胞的阿片肽受体可能参与OHSS的发病机制。进一步研究可采用OHSS鼠模型观察纳洛酮是否有预防或者治疗作用。这也为纳洛酮可作为临床上预防治疗OHSS提供新的思路。
5.6 抗苗勒氏管激素（AMH）信号通路异常

动物实验发现AMH不仅抑制始基卵泡生长, 也是生长发育中的卵泡对于卵泡刺激素（FSH）敏感性的负向调节因子。最近研究发现, AMH能够显著降低FSH引起的人颗粒黄体细胞的芳香化酶以及雌激素表达, 并且使细胞内FSH信号通路中的第二信使cAMP降低, 而敲低AMH受体2（AM-HR2）能够逆转AMH对于芳香化酶表达的抑制作用。但是实际临床工作中发现血清中AMH升高的女性通常对超促排卵过程使用的外源性促性腺激素的反应更强, 发生OHSS风险也会增加, 这与之前研究中AMH降低卵泡对于FSH的反应相违背, 可能的解释是在OHSS患者的AMH信号通路发生异常, 较高的AMH水平无法发挥其降低卵泡对于FSH反应性的作用。最近的研究发现OHSS患者颗粒细胞AMH受体表达显著降低, 在AM-HR2表达下调的OHSS模型鼠中, 小鼠对FSH反应增加, OHSS症状更加明显 , AMH信号通路异常如何参与OHSS的发生有待进一步研究。而这也提示AMHR2在颗粒细胞的表达水平的检测可能成为预测OHSS发生的指标。
5.7 炎症因子参与
5.7.1 CD11ct HLA-DR t树突细胞与其相关的白介素

CD11ct HLA-DR t树突细胞一直以来都被认为可能参与OHSS的发病, 其在炎症反应中发挥重要作用。最近研究表明OHSS患者卵泡液中与CD11ct HLA-DR t树突细胞相关的细胞因子白细胞介素10、12、18、23等显著升高 , 关于其如何参与OHSS发病机制尚待进一步研究。
5.7.2 IL-8的作用

OHSS患者的卵泡液能够增加体外培养的血管模型人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的通透性, 加入含IL-8抗体的卵泡液后显著降低其增加血管通透性的作用, 说明卵泡液中的IL-8对于血管通透性发挥着重要作用。溶血磷脂酸与颗粒细胞表面的溶血磷脂酸受体结合, 激活MAPK通路, 引起肿瘤坏死因子激活, 从而促进IL-8的表达增加, IL-8与血管内皮细胞表面受体结合使趋化因子受体1/2（CXCR1/2）磷酸化, 激活VEGF2受体, 进而通过激活Rho/Rock引起肌节蛋白的多聚化以及VE-cadherin和紧密连接蛋白闭合蛋白的磷酸化, 使内皮细胞间的紧密连接以及粘着连接打开, 提高血管通透性。
5.7.3 IL-6作用

IL-6需要与可溶性的白介素受体（sIL-6a）结合才能够发挥作用, 在小鼠OHSS模型中, IL-6R-IL-6复合物作用于卵巢血管内皮, 通过激活信号转导及转录激活因子3（STAT3）以及ERK促进内皮细胞表达VEGF, 进而使血管通透性增加。
5.7.4 色素上皮衍生因子（PEDF）

PEDF不仅是一种抑制血管生成的因子, 也是一种抗炎因子。正常生理状态下表达与VEGF处于平衡, 如果两者的表达比例异常, PEDF水平降低而VEGF的表达增加可能参与OHSS的发病。在黄素化颗粒细胞中, hCG作用在促进VEGF表达的同时, 会抑制PEDF的表达。给OHSS模型鼠注射重组PEDF（rPEDF） , 可明显缓解OHSS症状, 血管渗出减少, 体重增加以及卵巢体积增加较对照组减少, 卵巢中的VEGF、IL-6 mRNA以及蛋白水平都显著低于不给药组, 在人黄素化颗粒细胞中, 加入rPEDF明显抑制IL-8或hCG对VEGF表达的促进作用。因此, PEDF表达减少也是OHSS发病的重要机制。
5.8 色素上皮衍生因子（PEDF）

人卵巢膜细胞能合成肾素原和活化肾素, 卵巢中的肾素-血管紧张素系统与类固醇激素的合成、排卵、卵泡闭锁、黄体形成和卵巢血管新生都紧密相关。OHSS患者的卵泡液及血浆中肾素活性升高, 排卵后前体激活生成肾素, 催化血管紧张素原转化成血管紧张素1, 血管紧张素1被血管紧张素转化酶催化形成血管紧张素2, 血管紧张素2可以促进血管生成, 增加血管通透性, 并促进前列腺素的产生。关于临床使用ACEI和Ang-II拮抗剂预防治疗OHSS是否有效, 仍缺乏数据支持, 只有个别病例报道提示这两种药可能有预防作用。

六、卵巢储备功能

卵巢储备功能是指卵巢皮质区中的原始卵泡发育成为可受精的卵母细胞的能力。卵巢储备功能下降（diminished ovarian reserve, DOR）是指随着年龄的增长, 卵巢产生卵子的数量逐渐减少, 卵泡质量逐渐下降。DOR是卵巢功衰竭的前期状态, 进一步将发展为卵巢早衰（premature ovarian failure, POF）。目前临床上评估卵巢储备功能的指标主要有年龄、基础内分泌激素、细胞因子（AMH）、基础窦卵泡数（AFC）等, 但尚无诊断DOR的统一标准。
6.1 年龄

女性出生后, 卵巢内的卵泡数量是固定的。随着年龄的增长, 卵泡数量逐渐减少, 卵巢的储备功能也开始下降。研究表明, 女性30岁开始生育力逐渐下降, 35岁以后生育力下降速度逐渐加快, 41岁以后妊娠率极低。张秀萍研究结果表明女性年龄与卵巢低反应关系密切, 35岁前生育力无明显改变, >35岁者卵子数量及卵泡质量明显下降。但也有学者提出, 卵巢年龄与实际年龄并不完全一致, 与女性的心理因素、生活环境、家族史等有关。同时, 卵巢相关疾病如多囊卵巢综合征（PCOS）的患者, 其卵巢储备功能减退速度相对缓慢。因此, 年龄只能作为评估卵巢储备功能的粗略指标, 还应结合其他指标进行评估。
6.2 基础内分泌激素

卵泡刺激素（FSH）是由腺垂体促卵泡激素细胞分泌的, 与黄体生成素（LH）统称为促性腺激素。基础FSH通常在自然月经周期的第2~5天（即卵泡早期）进行检测。临床上认为FSH>10~15IU/L为卵巢低反应;FSH>20IU/L为POF隐匿期, 提示1年后可能闭经。国外研究表明基础FSH会随年龄增长而升高;早期FSH升高提示卵巢排卵功能下降, 卵巢储备功能降低。卵泡的发育不良常常伴有卵泡早期FSH水平的升高, 由于垂体对卵巢的低反应, 会通过下丘脑-垂体-卵巢轴的反馈调节, 使得促性腺激素释放激素代偿性升高, 从而提高FSH水平, 最终促进卵泡发育。因此, 基础FSH可在一定程度上反映卵巢储备功能。路天祥研究表明卵巢低反应组患者基础FSH水平高于非卵巢低反应组, 且与获卵数呈低度负相关;应用ROC曲线分析得出其灵敏度为0.64, 特异度为0.61, 认为基础FSH水平能预测卵巢储备功能。一项动物实验表明, 大鼠腹腔注射不同剂量顺铂并测定其动情前期血清基础FSH水平, 高剂量组大鼠血清基础FSH水平明显高于低剂量组及未注射顺铂时, 提示血清基础FSH水平变化在化疗药物剂量达到半数致死量时表现出来, 即卵巢功能损害达到一定程度才会出现血清基础FSH水平明显变化。因此, 基础FSH可帮助判断卵巢功能是否衰退, 但在早期评估卵巢功能衰退方面仍不可靠。在临床上, 医生应重视早期基础FSH的轻度升高, 及时检测其他卵巢储备功能指标, 明确病情, 改善预后。

在卵泡期, 卵巢雌激素的合成是由颗粒细胞和卵泡内膜细胞在FSH、LH的共同作用下完成的。雌激素在正常月经周期中动态变化, 通过对下丘脑和垂体的正负反馈调节, 以控制促性腺激素的分泌。在DOR早期, 基础雌二醇（E2）可先于FSH水平升高。赵晓利等研究表明, 女性月经周期第2天血清E2水平升高, 并通过负反馈调节抑制血清FSH水平, 这种情况会降低FSH评估卵巢储备功能的准确性。同时, 该研究发现女性月经周期第2天血清E2<45ng/L者周期妊娠率（19.7%）明显高于E2≥45ng/L者（3.9%）。可见, 基础E2水平能单独或加强基础FSH水平评估卵巢储备功能。然而, 雌激素水平易受到卵巢相关疾病、月经周期、药物等因素影响, 因此单用基础E2水平评估卵巢储备功能的临床价值相对有限。
6.3 AMH与血清抑制素B

抗缪勒氏管激素（AMH）又称为苗勒管抑制物质, 存在于转化生长因子β（TGF-β）中。1947年法国Jost教授在胚胎睾丸细胞中发现, 男性主要由睾丸间质细胞合成, 女性主要由卵巢早期生长卵泡的颗粒细胞分泌, 其浓度受始基卵泡的募集速度及卵泡储备的影响;因此AMH能反映原始卵泡及窦前卵泡的数量, 而不受下丘脑分泌的促性腺激素的影响。La等研究发现AMH不随女性月经周期而变化, 其对卵巢储备功能的评估价值优于基础内分泌激素。在卵泡发育过程中, AMH可抑制原始卵泡发育, 并降低生长卵泡对FSH的反应性。胡蓉等采用ELISA法检测228例不孕症患者月经周期血清基础AMH水平发现略低, 可能与不孕症患者年龄、人种差异有关。基础AMH水平与患者AFC明显相关, 且随着年龄的增长以及初潮至就诊年龄的延长, 其表达量逐渐下降。李莹等通过检测不同卵巢储备功能患者血清AMH水平, 结果发现PCOS组最高, POF组最低, 而正常组、PCOS组、DOR组与POF组比较, 差异均有统计学意义;提示血清AMH水平与卵巢储备功能的关系密切。张秀萍等研究表明, 基础AMH水平在女性35岁前变化不大, >30岁时开始下降, 35岁后呈直线下降;当血清AMH水平≤1.3ng/ml时, 其获卵数明显减少。以上结果提示基础AMH水平可评估卵巢储备功能, 尤其是年龄≥35岁的不孕症妇女。张新云等观察了100例18~46岁女性的基础AMH水平, 结果显示18~29岁女性基础AMH水平相对稳定, 30岁时开始下降, 37岁时降至1.43ng/ml, 但基础FSH水平无明显变化。因此, 将血清AMH水平1.15ng/ml作为预测体外受精治疗中女性DOR的诊断阈值, 其灵敏度、特异度分别为0.80和0.85。

血清抑制素B（INHB）是一种糖蛋白激素, 与AMH同属TGF-β超家族;它能反映生长卵泡的数量及质量, 可作为评估卵泡发育情况及卵子数量的标志物。IN-HB由中小窦状卵泡的颗粒细胞分泌, 在卵泡早期开始上升, 卵泡中期达到最大值, 排卵后在FSH、促黄体生成素（LH）峰出现后1~2d开始下降, 整个黄体期均处于低水平。梁秀云等对108例不孕症患者（卵巢低反应37例、卵巢正常反应71例）于月经周期第3天检测血清AMH、INHB、FSH水平, 同时采用彩色多普勒超声检查并测量AFC, 结果显示卵巢低反应组INHB水平、AFC均明显低于卵巢正常反应组。李辉关于INHB与卵巢储备功能的关系研究发现, 正常组、卵巢高反应组血清INHB水平均高于卵巢低反应组, 且血清INHB水平与获卵数的相关性较AMH低;同时发现血清INHB水平对卵巢储备功能的评估价值不大。Tharnprisarn等研究表明血清INHB水平不能评估卵巢的反应性, 对卵巢储备功能的预测灵敏度较低。目前关于INHB的临床价值仍存在争议, 尚需大量临床研究证实。此外, INHB的检测费用较高, 在临床使用中受到一定限制。

窦卵泡是成熟卵泡的前体, 窦前卵泡发育到一定的程度时, 颗粒细胞会产生卵泡液, 并形成卵泡腔。卵泡早期（月经周期第3~5天）超声检查, 可见直径2~10mm的基础窦卵泡。近年来, 国内外研究普遍认为AFC对卵巢反应性及其储备功能具有预测价值。Bancsi等研究发现女性月经周期第3天的AFC≤4个和（或）卵巢体积≤3cm3, 体外受精周期取消率明显升高, 取卵数及妊娠率明显下降, 故认为AFC是预测卵巢低反应的良好指标。赵明霞等对50例月经正常的健康育龄妇女及50例高龄不育的健康妇女进行超声检查, 结果发现健康育龄组AFC>15个, 高龄不育组<10个;提示AFC是反映卵巢储备功能的一项重要指标。王伟群等研究表明DOR组AFC明显低于卵巢储备功能正常组, 同时发现12例妊娠者的AFC均≥4个;提示经阴道彩色多普勒超声动态监测不孕症妇女月经周期AFC有助于卵巢储备功能的评估。王俊霞等应用ROC曲线评估年龄、AFC、基础FSH对卵巢储备功能的预测价值, 结果发现随着AFC的减少, 卵泡数量及质量明显降低, 即卵巢储备功能明显降低;该研究结果还表明, AFC对卵巢反应性的预测价值最高。可见, AFC是预测卵泡数量的良好指标, 但对卵泡质量的预测价值有限。
6.4 其他相关因素

遗传因素、医源性因素、免疫及感染因素、环境、社会心理和生活方式。

总之, 卵巢储备功能减退是一个渐进性过程, 多方面多因素的刺激导致卵巢储备功能下降。临床上应该进一步查明卵巢功能减退的病因, 早期预防和干预, 防止卵巢早衰的发生。对于有明确病因的有生育要求的妇女, 应该对因治疗, 尽早指导生育;对于无明确病因的病例可积极指导受孕, 必要时人工助孕, 中成药辅助治疗, 改善生活质量。对于医源性损伤, 建议最大限度的保护卵巢, 采取对卵巢刺激小、损伤少的术式或者止血方式或者化疗药物。同时建议育龄期妇女积极调整心态, 改变不良生活方式或者饮食, 积极备孕, 避免高龄妊娠。

七、AMH的生物学作用机制

AMH是转化生长因子β超家族的生长和分化的反应调节剂的一个成员。人类AMH基因位于19号染色体短臂（19p13.3）,长2.4~2.8 kb,有5个外显子,能编码560个氨基酸。AMH受体（AMHR）为丝氨酸/苏氨酸受体,有两种受体:Ⅰ型受体（AMHRⅠ）和Ⅱ型受体（AMHRⅡ）。AMHR基因总长7.6 kb,位于12号染色体长臂（12q12~13q）。AMH主要通过AMHRⅡ发挥作用。AMHRⅡ位于苗勒管周围的间充质细胞和两性性腺。AMH与AMHRⅡ连接成一个复合体,磷酸化后激活AMHRⅠ,而后AMHRⅠ磷酸化下游的Smads蛋白,磷酸化的Smads与Smad4结合形成复合物进入细胞核,调节蛋白表达。
7.1 AMH与卵泡发育
7.1.1 AMH抑制始基卵泡的起始募集

Weenen等研究显示AMH在直径<4 mm的小窦卵泡中表达最强,在直径>8 mm的窦卵泡中几乎无表达,在直径4~8 mm的小窦卵泡中表达介于上述两者之间。Durlinger等对敲除AMH基因小鼠进行研究,发现其出生时始基卵泡池正常,后来闭锁卵泡比野生型多,并伴随始基卵泡减少,这可能是因为AMH缺失引起卵泡发育过度。出生25 d的AMH基因敲除小鼠的卵巢有大量生长卵泡,13个月大时几乎检测不到始基卵泡,这可能是由于缺乏AMH,原始卵泡大量募集并发育,从而导致始基卵泡过度消耗。Carlsson等将卵巢皮质组织活检标本切成小块,并分别置于放有0,10,30或100 ng/mL培养基中培养7 d,开始观察到几乎所有培养基中的卵泡均显著生长,但与非培养的对照组织相比,原始卵泡显著生长比例较小（14%~26%vs.56%）。不同浓度的AMH培养基中原始卵泡的存活率差异无统计学意义,表明培养基组织中原始卵泡存活率不受AMH浓度影响。综合上述实验及相关研究,卵泡发育与AMH相互作用关系为:因为基础AMH抑制始基卵泡发育,卵泡池中一部分始基卵泡的颗粒细胞转化为单层立方颗粒细胞,即始基卵泡发育为初级卵泡,此时AMH分泌开始增加,而后颗粒细胞增殖,AMH进一步增加,初级卵泡发育为次级卵泡,初级卵泡及次级卵泡阶段统称窦前卵泡。此过程由于AMH的抑制作用而缓慢进行,需时9个月,同时AMH又可抑制更多始基卵泡发育成窦前卵泡,即抑制了始基卵泡的起始募集。
7.1.2 AMH通过抑制卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone,FSH）从而抑制卵泡发育

有研究加入不同浓度AMH,比较各组间小鼠颗粒细胞上FSH受体（FSHR）的m RNA表达情况,结果发现随AMH浓度的增加,小鼠颗粒细胞上FSHR m RNA的表达量反而减少。FSH是由垂体分泌的一种糖蛋白激素,主要作用是促进颗粒细胞增生分化,并通过与卵泡表面的FSHR结合发挥调节卵泡作用,而AMH能够拮抗FSH对卵泡生长的促进作用,也就是AMH间接通过FSH发挥其对卵泡发育的抑制作用。Chang等研究人类粒层-叶黄素细胞（h GL）中AMH对FSH诱导的细胞色素P450芳香化酶和雌二醇（E2）的作用。该研究显示原代培养的h GL添加AMH后,细胞色素P450芳香化酶和E2的表达量降低,而未添加AMH的原代培养的h GL内细胞色素P450芳香化酶和E2基本无变化。对AMH处理组细胞研究发现AMH是通过抑制FSH诱导的环磷酸腺苷（c AMP）影响细胞色素P450芳香化酶和E2的表达。敲除AMHRⅡ基因后,h GL添加AMH不影响细胞色素P450芳香化酶和E2的表达量。这说明AMH是通过AMHRⅡ抑制FSH诱导的腺苷酸环化酶的激活以及芳香化酶的表达和E2的产生。因此推测窦前卵泡的颗粒细胞内出现FSHR,AMH作用于AMHR抑制FSH,使受FSH诱导产生的c AMP减少,从而细胞色素P450芳香化酶和E2产生减少,最终抑制卵泡的生长发育。但目前仍缺乏更多的证据,尚需大量研究证实。
7.2 AMH与卵巢储备功能

卵巢储备功能是指卵巢内存留的卵泡数量和质量,其决定卵巢皮质区形成可受精卵母细胞的功能,是衡量女性卵巢功能和生育能力的重要指标。通常采用月经第2天或第3天FSH、E2、抑制素B（INHB）及阴道超声测量月经第2天或第3天卵巢基础窦卵泡计数（b AFC）来反映原始卵泡库存情况。最近AMH成为一项新的评估卵巢储备功能的检测指标。AMH与旧的检测指标比较有以下优点:1研究发现AMH水平与早期窦卵泡数呈正相关,可相对真实地反映原始卵泡库存情况,而且避免了超声下计数AFC的繁琐和人为误差,结果更加客观、准确。2AMH和年龄变化关系密切,且较其他指标更早反映各年龄期间的生殖内分泌变化,其中INHB、FSH、E2随年龄变化不明显,FSH、E2在卵巢老化末期才有变化,并不能早期评估卵巢功能。3多项研究表明AMH具有周期稳定性,在整个月经期无明显波动。然而也有一些研究表明AMH有周期波动性,在卵泡期和黄体期水平有差异。目前临床上较多赞同AMH在月经周期中有波动,但波动非常小。因此在月经周期的任意一天检测AMH均有临床意义,较其他检测指标应用更加广泛。当然,尚需大量临床研究来鉴定AMH在月经周期中的变化情况。4与旧的检测指标相比,血清中AMH浓度不受口服避孕药的影响,但也仍需大量临床研究证实。
7.3 AMH与卵巢疾病
7.3.1 AMH与多囊卵巢综合征（PCOS）

PCOS临床上主要表现为卵泡发育障碍的排卵障碍及内分泌紊乱（表现为高胰岛素及高雄激素血症）。其在临床发病率达5%~10%,已经成为影响女性健康的重要疾病之一。

有研究表明AMH可以较为准确地诊断PCOS。AMH主要在窦状卵泡中产生。PCOS患者的卵泡发育停留在窦前和小窦卵泡阶段,卵泡成熟发生障碍,这可能是导致PCOS患者AMH水平高的原因之一。而且PCOS患者主要的内分泌特征是高胰岛素和高雄激素血症,由此猜测这两种激素可能与PCOS患者AMH升高有关。研究表明PCOS患者卵巢局部AMH的高表达与高胰岛素血症及高雄激素有关,PCOS患者血清中AMH水平与血清中雄激素水平及胰岛素水平呈正相关。但是有研究发现AMH与雄激素的关系尚不能确定。多项研究结果显示,一方面PCOS患者高胰岛素水平促进了卵泡的募集,而募集的卵泡增加会引起窦卵泡数量增加,AMH主要由窦状卵泡产生,最终AMH水平增加。AMH会抑制原始卵泡的募集及卵泡发育,这可能是PCOS患者原始卵泡募集增多但是卵泡成熟障碍的原因之一。另一方面,雄激素可刺激窦卵泡产生,也就是AMH的产生会增加,而AMH又会阻止卵泡发育,这与胰岛素作用类似,可以用来解释PCOS患者排卵障碍及高胰岛素及高雄激素血症。然而,AMH与PCOS及PCOS相关激素之间相互作用的关系仍需要更多的实验研究证实。

Sir-Petermann等研究发现PCOS患者女儿在婴幼儿及儿童期血清AMH水平显著增高,由此推测PCOS的发病机制可能与遗传有关,也就是与基因相关。Yoshida等对80例日本妇女的外周血进行DNA测序以期了解AMHRⅡ单核苷酸多态性（SNPs）,发现AMHRⅡ-482A>G多态性可能与PCOS患者的卵泡发育障碍有关。Sproul等在证实了上述观点的同时发现PCOS患者AMH基因表型以T/T为主,而正常女性以G/T为主,说明PCOS与AMH基因多态性密切相关。Georgopoulos等对PCOS患者与健康女性进行比较研究发现,PCOS患者AMHRⅡ-482A>G多态性明显增加,同时PCOS患者伴有低LH和低LH/FSH以及低泌乳素（PRL）者纯合AMHR2-482>G基因多态性（GG）更常见。目前AMH基因与PCOS之间的具体关系仍不能明确,只能说明PCOS与AMH基因多态性有关,但具体与某一个基因或一组基因的关系尚待大量研究发现。

AMH是由二硫键连接而成的糖蛋白二聚体 ,不直接作用于卵母细胞,主要通过与受体结合在卵泡发育与成熟过程中发挥重要的调控作用。AMH受体分为Ⅰ型（AMHRⅠ）和Ⅱ型（AMHRⅡ）两种,均属单次跨膜丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶受体。卵巢颗粒细胞AMH作用于颗粒细胞特异性AMHRⅡ, 形成的复合体磷酸化激活AMHRⅠ（Alk2、3、6）并形成异聚体受体三元复合物,活化的AMHRⅠ再特异性磷酸化激活细胞内受体激活型Smads,即R-Smads（包括Smad1、5、8）或抑制型Smads,即I-Smads（包括Smad6、7）,激活物与Smad4形成多聚体 , 进入核内调控靶基因的转录和表达,使信号向细胞内转导。胡蓉等研究发现颗粒细胞中AMH通过降低人卵巢黄素化颗粒细胞干细胞因子（stem cell factor, SCF） m RNA及蛋白表达 , 抑制SCF对卵子生长启动及成熟的促进作用, 从而推测这可能是AMH调节卵泡募集的途径之一。另有研究发现基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinase 2,MMP2）、肿瘤易感基因（Wilms tumor type 1, WT1）等参与了AMH信号转导的上、下游调节, GATA、类固醇生成因子（steroidogenic factor -1, SF -1）、SOX -9等亦参与了AMH基因的表达调控。此外,Pellatt研究证实过高的AMH抑制了卵泡发育及卵母细胞的成熟。 AMH水平逐渐降低可能是卵泡优势化选择的必备条件, 近期研究发现AMH亦参与了调控卵母细胞成熟的最后阶段,但具体作用机制尚不十分清楚。
7.3.2 AMH与卵巢功能早衰（premature ovarianfailure,POF）

POF是指女性40岁以前卵巢功能衰竭,主要特征为闭经、促性腺激素水平升高、雌激素水平降低,是导致女性不孕的主要原因之一。临床上用FSH及E2来诊断POF,经此诊断的患者大都已绝经,对患者造成严重影响。所以临床医生一直致力于发现更敏感的指标,期望能更早地诊断POF。POF发病多由于原始卵泡储备过少,卵泡闭锁或耗竭。AMH可以影响卵泡发育,同时AMH也是评价卵巢储备功能的敏感指标,所以通过AMH诊断早期POF成为近年来的研究热点。Knauff等研究发现有25%的早期卵巢功能障碍患者血清AMH浓度较正常排卵女性低5%,而过渡期卵巢功能障碍患者中有66%;有7%的早期卵巢功能障碍患者血清中检测不到AMH,而在过渡期卵巢功能障碍患者中有52%。有学者认为检测AMH能够早期预测卵巢功能的变化,尤其对那些有FSH升高的年轻患者诊断较为敏感。所以在临床上可以通过检测AMH水平评估卵巢功能,一旦血清中几乎检测不到AMH便可以诊断为POF,此时无论患者年龄及情况,有生育要求者需采取积极有效的助孕方式。

国内首次报道检测100例POF患者中有1例患者AMH基因114位核苷酸由G突变为A,导致372位氨基酸由丙氨酸替换为酪氨酸。虽然以上报道仅1例,但是可以推测POF可能与患者AMH基因突变有关,这样就可以从基因水平研究治疗POF的方法。当然,AMH与POF的关系仍需大量研究证实。
7.3.3 AMH与卵巢颗粒细胞瘤（granulosa cell tumorof ovary,GCT）

GCT是一种恶性的性索间质肿瘤。临床上预后较好,5年生存率达80%以上,但有晚期复发倾向。所以临床需要一个敏感的指标进行监测,希望能更早地发现。由于AMH在卵巢颗粒细胞中产生,所以猜测AMH可以作为一个检测卵巢GCT的指标。F覿rkkil覿等发现血清AMH检测出GCT的敏感度为92%,特异度为81%,是GCT敏感和特异的标记物;研究同时还发现AMH联合INHB显著提高了GCT的检出率。总之,血浆AMH浓度可能是诊断GCT的一个更可靠的和敏感的生物指标。同时125I标记的AMH与卵巢GCT细胞能特异性地进行连接,这为运用125I-AMH抗体对GCT进行放射性免疫诊断和治疗提供了可行性的依据。
7.4 AMH与辅助生殖技术（assisted reproductive technology,ART）
7.4.1 AMH为ART的个性化治疗提供可靠证据

近年来ART发展迅猛,但是其成功率却一般。临床上想要成功妊娠需要有一定数量的优质卵细胞,因此需要对患者的卵巢储备功能加以了解,并对卵泡池中的卵子数量与质量及卵巢反应性进行评估,从而制定个体化方案以提高获卵率及临床妊娠率。有研究发现AMH在ART前能准确地预测卵巢反应性,为制定个体化刺激方案提供可靠依据。同时AMH是体外受精（IVF）治疗中卵巢反应性的最佳检测指标,AMH浓度高通常卵巢反应性高,仅需给予小剂量FSH,而AMH浓度低通常卵巢反应低,需要大剂量FSH。将AMH为2.97 ng/mL作为临界值预测卵巢低反应的敏感度为100%,特异度为89.6%。又有研究表明控制性超排卵周期卵泡发育早期（促排卵5 d）的血清AMH水平较基础AMH水平能更好地预测卵巢反应性。这说明可以将AMH的定量指标运用到ART中,预测卵巢储备功能,评估及预测妊娠结局,甚至可以在早期对患者进行干预以提高ART成功率。
7.4.2 AMH与卵巢过度刺激综合征（ovarianhyperstimulation syndrome,OHSS）

OHSS是ART的主要并发症,在促排卵和IVF中的发生率为1%~4%。Ocal等研究发现血清AMH水平和AFC可以预测行IVF/胞浆内单精子注射（ICSI）患者的OHSS发生,其中将AMH为3.3 ng/mL作为临界值预测行IVF/ICSI患者发生OHSS的敏感度为90%,特异度为71%。而后赵义清等初次对AMHRⅡ基因与OHSS的关系进行研究,结果显示OHSS患者AMH基因第1号外显子的146位G>T、第2号外显子的134位G>A均存在突变,且这2个突变点正处于AMH的氨基端编码区域。但是OHSS的发生与突变的相关关系及具体作用过程尚待进一步研究。
7.5 AMH与绝经年龄

AMH与年龄变化关系密切,女性出生时,血清几乎检测不到AMH,出生后几周血清AMH浓度开始缓慢上升,至生育年龄期间血清浓度达高峰,绝经前15年~绝经前5年AMH水平呈对数级下降,之后低至不可测,绝经后无法检测到。AMH是最早随年龄增长发生变化的卵巢功能评估指标,更能准确反映卵巢生殖功能的下降和预测绝经过渡期的到来。有研究发现通过母亲绝经年龄和围绝经期来预测子代绝经年龄有一定的临床意义。在发现AMH与绝经年龄关系密切后,有学者通过观察多对母女绝经年龄以及AMH发现,通过AMH预测绝经年龄比目前使用的利用患者卵巢功能或母亲绝经年龄预测子代绝经年龄的预测效果更佳,而且利用女性的年龄与AMH共同预测绝经年龄对预测绝经年龄效果最佳,但加上利用母亲绝经年龄来预测子代绝经年龄并不能明显增加预测准确率。目前仍需大量研究证实AMH与绝经年龄的关系并加以数据化分析后才能运用于临床。

八、AMH检测技术与试剂框研究进展

早期建立的AMH检测方法是免疫细胞化学检测及放射免疫分析技术（radioimmunoassay, RIA） , 研究侧重于AMH在动物组织中的定位及功能研究, 无法应用于临床检测诊断。为满足AMH检测的需求, Immunotech（IOT）与Diagnostic Systems Laboratories（DSL）先后推出了两个孤立的商品化ELISA检测试剂框。第一代ELISA检测试剂框使用的配对抗体及标准品都不一样, 因此获得的检测结果差异较大。为了获得统一的AMH检测标准, Beckman-Coulter整合了这两个商品化ELISA检测试剂框, 建立了第二代ELISA检测技术。另外, Ansh Labs在2012年及2013年分别推出了两个商品化的AMH ELISA检测试剂框, 即超灵敏的AMH ELISA检测试剂框及pico AMH ELISA检测试剂框, 本文依据其检测原理同样把它们列为第二代ELISA检测技术。2014年, 罗氏诊断率先推出全自动AMH检测系统──Elecsys®AMH检测系统, 标志着AMH检测技术进入了全自动化阶段。紧接着, Beckman-Coulter也推出了全自动的AMH检测──Access AMH检测系统。
8.1 AMH及早期检测技术

AMH隶属于转化生长因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）超家族, 相对分子质量（Mr） 140×103, 是由两个相同的Mr72×103的亚基, 通过二硫键连接组成的二聚体糖蛋白。在分泌之前, AMH每个亚基由N末端结构域或称“可变区”, C末端结构域或称“成熟区”组成。人类的AMH基因编码于19号染色体的短臂, 大小2.4~2.8 kb, 包含5个外显子。AMH是男女性腺功能的重要标志之一, 在性腺发育过程中发挥重要的作用。在男性, AMH由睾丸支持细胞产生, 抑制缪勒氏管发育, 诱导男性生殖管道的产生 ;在女性, AMH产生于卵巢的窦前及小窦状卵泡的颗粒细胞, 抑制始基卵泡的启动, 抑制窦卵泡对卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone, FSH）的敏感性, 调节卵泡的发育。

AMH水平在月经周期中相对稳定, 不受激素避孕药的影响, 其检测便于临床应用[189,199,200]。应用AMH检测卵巢储备功能, 能灵敏及特异性地预测卵巢反应。在众多卵巢储备功能的评估指标中, AMH是卵巢储备功能的直接指标, 是最早随年龄增长发生改变的指标。其血清水平与年龄呈负相关, 可敏感地评估年龄相关的生育能力的下降[197,202]。Van等提出AMH 0.086 ng/mL可作为预测绝经的界值, Tehrani等随访1051例20~50岁正常生育期女性AMH血清水平, 实际绝经年龄与模型预测相差0.5（±2.5）年左右, 模型可信度达92%。AMH血清水平检测也应用于多囊卵巢综合征及卵巢早衰的诊断[205,206], 同时AMH可作为卵巢颗粒细胞瘤（GCT）的一种特殊标志物, 对GCT的治疗及复发监测有重要的临床意义。另一方面, AMH在ART前能准确地预测卵巢反应, 对患者进行正确评估, 预测患者进行ART的可能性, 制定个体化的理想的卵巢刺激方案及FSH剂量, 在一定程度上能提高妊娠率, 并降低并发症风险[208,209,210]。

最早的AMH检测技术可追溯到1982年, Tran等利用免疫细胞化学技术检测AMH在牛塞尔托利氏细胞的粗糙内质网中的定位, 使用的是抗牛AMH的单克隆抗体（#278） , 其能直接阻断牛AMH的活性及分泌。Bezard等同样利用免疫细胞化学技术检测山羊卵巢颗粒细胞中的AMH。Vigier等建立了一种检测牛血清中AMH的含量的灵敏的RIA方法。这种方法利用两个单克隆抗体（#6及#278） , 其灵敏度是其他生物活性鉴定技术的600倍以上, 能达到1 m U/mL, 且能应用于牛血清中AMH的检测。Necklaws等建立了一种检测牛生物样本中AMH含量的夹心RIA方法。此检测方法的灵敏度能达到0.14 pmol/mL, 且与鸡、大鼠、小鼠、人AMH无交叉反应, 能很好地应用于牛生物样本中AMH含量的测定。因此, 早期建立的AMH检测方法研究侧重于AMH在动物组织中的定位以及功能研究, 无法满足临床检测诊断的需求。
8.2 第一代AMH ELISA检测技术

1990年Hudson等率先建立了第一个AMH ELISA检测方法, 以纯化的鼠单克隆抗体6E11（识别的是AMH的“可变区”）作为捕获抗体包被, 重组的纯化人源AMH蛋白作为标准品, 加入AMH的兔抗血清（1:1000）后, 再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记小鼠抗兔二抗进行检测。其灵敏度可达0.5 ng/mL, 与同家族TGF-β1, TGF-β2, 黄体生成素（LH）及FSH无明显交叉。但Lee等研究表明, 此方法易受样品储存及反复冻融的影响, 稳定性较差。2000年Long等建立了第二个AMH ELISA检测方法, 称为高灵敏度AMH ELISA, 用于检测低浓度AMH, 从而诊断GCT。此方法以纯化的鼠单克隆22A2作为捕获抗体包被（识别AMH的“可变区”） , 重组的纯化人源AMH蛋白作为标准品, 生物素偶联的鼠单克隆抗体11F8（识别AMH的“成熟区”）为检测抗体, 与HRP偶联的亲和素孵育后加入底物显色。此方法的灵敏度达0.7 pmol/mL, 其用途在于GCT病人中低浓度AMH的检测。2005年Alqahtani等建立了第三个AMH ELISA检测方法, 并检测表明, 不育男性血清AMH水平低于正常男性;妊娠女性血清AMH水平高于正常女性。此方法以纯化的鼠单克隆抗体2/6C（识别AMH“可变区”）为捕获抗体, 重组的纯化人源AMH蛋白为标准品, 生物素偶联的鼠单克隆抗体9/6A（同样识别AMH“可变区”）作为检测抗体, 与HRP偶联亲和素孵育后加入底物显色。此方法的灵敏度达到0.078ng/mL。

1999年, IOT推出了第一个商品化的AMH ELISA检测试剂框。IOT试剂框使用的是一对鼠单克隆抗体, 一个抗体识别AMH的“可变区”, 另一抗体识别AMH的“成熟区”。2003年, DSL推出了第二个商品化AMH ELISA检测试剂框。DSL试剂框使用的同样是一对鼠单克隆抗体, 但这一对抗体识别的都是AMH的“成熟区”。IOT试剂框与DSL试剂框使用的标准品及配对抗体皆不相同, 其结果差异也较大（从5倍差距到检测结果一致）。Freour等使用DSL试剂框检测AMH的结果仅是IOT试剂框检测结果的22%;Zhao等使用DSL试剂框检测结果是IOT试剂框检测结果的66%;而Lee等使用DSL试剂框检测结果与IOT试剂框检测结果一致。综上, 第一代AMH ELISA检测技术使用的多是一对配对的AMH单克隆抗体, 已开始满足临床检测的需求, 但没有统一性的检测标准, 其结果易受样品储存及反复冻融的影响, 稳定性较差, 且商品化试剂框之间检测结果的差异也较大。
8.3 第二代AMH ELISA检测技术

2010年Beckman Coulter整合了DSL以及IOT商品化ELISA检测试剂框, 统一了AMH检测标准, 建立了第二代AMH ELISA检测技术。Beckman的第二代AMH ELISA检测技术采用的原理依然是两步ELISA夹心法, 使用的是DSL试剂框的抗体及IOT试剂框的标准品。试剂框的检测灵敏度达0.08 ng/mL, 不仅能应用与人AMH血清检测, 同样适用于猴、牛等其他哺乳动物物种的AMH检测, 广谱性较高（检测其他哺乳动物AMH使用的标准品为重组牛AMH蛋白）。Li等对比Beckman第二代AMH ELISA检测试剂框与DSL及IOT商品化ELISA检测试剂框发现, 3种试剂框的一致性较好, Beckman第二代ELISA试剂框的AMH检测结果略高于其他两种。然而, Wallace等验证表明Beckman的AMH检测结果要高于其他两种约40%以上。Rustamov等的研究表明Beckman的AMH检测结果低于DSL试剂框的检测结果约20%~40%。这表明Beckman的第二代AMH ELISA检测技术虽然优于第一代AMH ELISA检测技术, 但依然存在AMH检测结果不稳定的问题, 易受样品的保存以及不同操作者的影响。另有文献报导第二代AMH ELISA检测在样品稀释后获得的实验结果线性较差, 可靠性较低[225,226]。为此, Beckman改良试剂框的操作步骤, 推出了改良版第二代ELISA检测试剂框, 增强了实验结果的可靠性。

另外, Ansh Labs在2012年及2013年分别推出了两个商品化的AMH ELISA检测试剂框, 即超灵敏的AMH ELISA检测试剂框及pico AMH ELISA检测试剂框[228,229]。这两个试剂框使用的是同一对配对鼠单克隆抗体, 克隆39/6C识别的是AMH的稳定的“可变区”线性表位, 克隆39/30A识别的是AMH的“成熟区”。pico AMH ELISA检测试剂框采用经典的两步ELISA夹心法, 检测灵敏度达0.012 ng/mL, 线性范围0.043~2.38 ng/mL, 特异性应用于人AMH检测, 与同家族FSH, LH及TGF-β无明显交叉反应, 适用于低浓度的人AMH检测;超灵敏的AMH ELISA检测试剂框采用化学发光分析法, 克隆39/6C作为捕获抗体, 克隆39/30A作为检测抗体（生物素标记） , 底物为鲁米诺化学发光底物, 其检测阈值达0.03~440 ng/mL, 适用于高浓度AMH的检测。Welsh等验证结果表明, 虽然Ansh Labs的两个商品化AMH ELISA试剂框使用的标准品与Beckman的不一致, 但依然适用于临床及科研研究, 相比于Beckman的试剂框, 超灵敏的AMH ELISA检测试剂框具有更为广阔的检测阈值。Su等进一步对比Beckman第二代AMH ELISA检测试剂框与Ansh Labs的两个商品化AMH ELISA试剂框, 发现3种试剂框的AMH检测结果相关性较高（r=0.92~0.99） , Beckman的AMH检测结果要低于Ansh Labs的两个试剂框的检测结果, 且随着AMH水平的上升这种差距更加明显;相比于Beckman第二代AMH ELISA检测, pico AMH ELISA检测更加适于低浓度AMH的检测。

综上, Beckman的第二代AMH ELISA检测技术虽然优于第一代AMH ELISA检测技术, 但依然存在AMH检测结果不稳定的问题, 此问题已经获得改善;与Beckman的AMH检测相比, 超灵敏的AMH ELISA检测试剂框具有更为广阔的检测阈值, pico AMH ELISA检测更加适于低浓度AMH的检测。
8.4 全自动AMH检测技术

2014年罗氏诊断推出了第一个全自动AMH检测系统──Elecsys®AMH检测系统, 标志着AMH检测技术进入了全自动化阶段。Elecsys®AMH检测系统仅需50μL人血清或肝素血浆样本, 检测范围为0.01~23 ng/mL, 灵敏度达0.01 ng/mL。与Beckman的第二代ELISA检测相关系数达0.98, 回归斜率0.81, 检测结果稳定可靠, 样品室温（20~25℃）保存或低温保存4-8℃7 d, 反复冻融或-20℃及-80℃保存9个月, 检测结果无明显改变。Elecsys®AMH检测系统使用的是电化学发光免疫系统, 配对抗体为Beckman的第二代AMH ELISA试剂框所用抗体。检测样本首先与配对单克隆抗体孵育, 一个为生物素标记的捕获抗体（F2B/12H） , 另外一个为钌标记抗体（F2B/7A） , 形成抗体-抗原-抗体复合物。随后加入亲和素包被的磁珠孵育, 利用生物素-亲和素系统, 把抗体-抗原-抗体复合物固定到磁珠上。随后, 电极捕获磁珠, 去除其他未结合的物质, 基于钌/三丙胺电化学发光检测系统进行检测, 全程仅需18 min。

随后, Beckman Coulter也推出了其全自动AMH检测Access AMH检测系统。其检测原理与罗氏诊断的Elecsys®AMH检测系统不同, 采用的是同时一步夹心化学发光免疫分析法, 但使用的是同一对抗体（即第二代ELISA试剂框所用抗体）。一个抗体包被在顺磁珠上作为捕获抗体（F2B/12H） , 另一个抗体标记碱性磷酸酶（F2B/7A）作为检测抗体。样品与抗体孵育后, 清洗去除杂质及非特异性结合的杂蛋白, 加入化学发光底物进行检测, 整个实验流程大约40 min。Beckman的Access AMH检测系统灵敏度达0.0077 ng/mL, 线性范围0.15~22.5 ng/mL, 与第二代ELISA检测相关系数达0.99~1, 回归斜率达0.89~0.92, 检测结果稳定可靠, 样品保存室温48 h, 低温2~8℃保存7 d, -20℃保存15个月, AMH检测结果无明显差异。

Hyldgaard等对比罗氏的Elecsys®AMH检测与Beckman第二代ELISA AMH检测。结果表明, 这两种方法有很好的相关性, 两者结果的偏差约为32%, 罗氏的AMH检测结果低于Beckman的ELISA检测结果;第二代ELISA AMH检测误差为5.5%~10.3%, 而Elecsys®AMH检测误差仅为2.8%~3.3%;Elecsys®AMH检测的检测限（LOQ）仅为0.5 pmol/L, 而第二代ELISA AMH检测的LOQ达3pmol/L。Pearson等比较了Access AMH检测系统与第二代ELISA AMH检测。结果表明, 这两种AMH检测方法具有极高相关性, Access AMH检测系统表现出较小的测定误差及良好的样品稳定性, 这两种AMH检测方法在临床应用上可相互替换。Van等对比了两种全自动AMH检测系统与Beckman第二代ELISA AMH检测这3种方法。结果表明, 两种全自动AMH检测系统与第二代ELISA检测方法的相关性较高, Access AMH检测与第二代ELISA检测的结果偏差为9%, Elecsys®AMH与第二代ELISA检测的结果偏差为12%, 两种全自动AMH检测结果略低于第二代ELISA的检测结果;两种全自动AMH检测系统具有较小的检测结果误差及较高的分析灵敏度。综上, 全自动化的AMH检测系统与第二代ELISA检测技术的相关性较高, 为临床AMH检测提供了更灵敏、准确、方便、快速的检测方法。

国内AMH商品化检测系统发展较为落后, 基本被国外顶级体外诊断试剂厂家所垄断。且AMH检测系统仅在少数三甲医院配备, 普及率极低, 检测价格昂贵, 严重制约了国内AMH检测的推广。此综述旨在帮助国内研究人员借鉴国外AMH检测技术的发展及其优势, 尝试建立快速、稳定、准确、灵敏的人工AMH检测系统, 降低AMH检测费用, 推动国内AMH检测的推广。在此基础上, 进一步开发出具有自主产权的全自动AMH检测系统, 实现进口替代, 把AMH检测纳入常规临床检验, 为中国女性及不孕症患者提供全方位的生殖健康管理。