全外显子测序技术

在过去10年里，随着高通量测序技术的出现与发展，科研与临床医学领域的遗传学检测范围不断扩大，检测速度不断加快。时至今天，DNA测序技术不仅推进了遗传学研究，也被用于各种遗传疾病的检查。特别是利用全外显子组测序（whole exomesequencing，WES）与全基因组测序（wholegenome sequencing，WGS）两种方法发现基因变异，被越来越多的应用于科学研究与临床诊断。这两种方法都基于一种能够快速且大量对进行DNA测序的新技术，被称作二代测序技术。

什么是全外显子组测序与全基因组测序？

全外显子组测序，是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕获富集后进行高通量测序，能够直接发现与蛋白质功能变异相关的遗传变异，虽然外显子只占基因组的1%，但人类基因组的蛋白编码区大约包含85%的致病突变，测序深度更高，数据更有效，变异检测更准确。

利用二代测序技术，对大量DNA片段进行测序已经完全可行了。例如，一部分DNA片段含有蛋白质合成的密码“指令”，这部分片段被称作“外显子”。目前认为，外显子只占到人类基因组的大约1%，基因组中所有的外显子被统称为“外显子组”，对这部分序列的测序就被称为“全外显子组测序”。这种方法能够检测出所有基因的蛋白质编码区域的变异，而不仅仅是被选择的有限的若干基因。由于已知的大多数导致疾病的突变均发生在外显子中，全外显子组测序从而被认为是一种高效的识别可能致病的突变的方法。

不同于全基因组测序（WGS），全外显子测序（WES）关注基因组的外显子区域，即蛋白质编码区域，是目前更适用于临床的高深度测序技术。原因在于，外显子区域虽然仅占基因组1.5%的比例，包含22000个基因，但超过85%的孟德尔遗传病都与该区域有关。因此WES较WGS更具成本效益。此外，目前人类探明的基因组内区域是极其有限的。相比于WES，WGS虽然能够发现更多的基因变异，但会有相当一部分变异的意义是不明确的，有时候很难断定某些检测出的变异是否与表型相关。据此，产前WES是在满足成本效益前提下，能有效提高超声异常胎儿在发育过程中致病突变诊断率的方法，同时其也有助于发现与确诊部分疾病孕期的表型。

相比于选择性的基因测序，全外显子组测序与全基因组测序能够发现更多的基因变异，但显然会有相当一部分的变异的意义是不明确的。并不是所有的基因变异都会影响健康，因此很难断定某些检测出的变异是否与患者的疾病、表型等相关。有时，一种被识别出的基因变异还可能与另一种尚未被诊断的遗传疾病有关。

全外显子测序技术从科研工具转向临床诊断遗传病不过几年光景，其在产前诊断中的应用业已成为遗传学等专业会议的热议话题。该技术是否已足够成熟？而临床医生是否已经准备好迎接这项尖端技术的引入呢？

以往对于产前超声检测发现异常的胎儿通常是采用核型分析进行遗传病的排查，其诊断率为8-10%；而后续通过染色体微阵列芯片（CMA）等技术诊断也仅是提高了6%的诊断率。这意味着仍有许多其他超声异常的病例存在，而且这些未检出的病例仅能依靠有限的信息进行遗传咨询，这无疑使医生与准父母面临着巨大挑战。目前，国内外有一些小规模研究发现，WES在超声异常核型分析正常胎儿中诊断率可达20%-80%，这使得WES在改善超声异常产前诊断中的应用受到广泛关注。但目前，WES在产前的临床应用仍面临着一定的挑战，比如：

1.如何短时间内进行大量的数据分析与解读；

2.如何识别低外显率和可变表现度的疾病；

3.针对未知意义的变异，如何提供准确的预测与遗传咨询。

4.WES不能检测非整倍体、多倍体、平衡易位、CNV等染色体异常；

5.基因组部分区域，特别是GC富集区，WES难以有效覆盖，可能存在漏诊的状况；

因此，对于行产前WES的同时，核型分析、CNV检测仍是必须的；一代测序作为二代测序的验证手段仍不可避免。此外，与产前WES有关的多重伦理问题也已经引起了广泛关注。对于检测结果的告知与解释可能导致不必要的终止妊娠的发生，尤其是对于未知意义的变异的知情同意仍然缺乏行之有效的方法与标准。

综上所述，WES在临床产前诊断中的推广使用，具有巨大的潜力与广泛的前景。它可以切实地解决部分超生异常但核型正常胎儿的遗传诊断问题，但也面临遗传解读与报告方面的诸多困难。

最近基因组学进入围产医学的应用爆发已经彻底改变了产前诊断和胎儿医学，携带胎儿结构性出生缺陷的所有女性均接受羊膜穿刺术或绒毛膜绒毛取样的诊断检测。以前，接受诊断检测的女性仅限于接受G带核型，2012年，Wapner等人发现在胎儿异常情况下，使用染色体微阵列芯片超过标准核型分析提高了6％的诊断率。这项研究改变了产前诊断的临床实践，因为当诊断出胎儿异常时，所有女性现在都被提供CMA检测。在CMA检测结果仍为阴性的情况下，现在大家把注意力转向产前全外显子组测序的临床效用。外显子组的改变导致大多数单基因疾病，现在可以在特定病例中提供研究性质的产前全外显子测序（WES），而有些机构已经在临床上直接提供产前WES。由于当前难以解释基因组的内含子区域，全基因组测序虽然在科研中有所触及，但尚未在临床上应用。

WES:应用于临床异常胎儿

目前，产前诊断仅限于超声检查，然后是标准核型分析和对羊膜细胞或绒毛膜绒毛进行微阵列检查。虽然微阵列分析提高了标准核型分析的诊断能力，但70-80％具有正常核型的异常胎儿也具有正常的微阵列检测结果，因此这些胎儿仍然没有获得明确的诊断。WES现在已在疑似遗传病的成人和患有畸形特征和发育迟缓的儿科患者常规进行检测，诊断率约为30％。

WES直到最近才应用于产前羊膜穿刺术和绒毛膜绒毛取样的直接胎儿标本。产前WES能够在标准基因检测未能揭示诊断的特定病例中鉴定出致病原因。然而，尽管产前样本的全基因组和外显子组测序的技术没有问题，其仍然需要侵入性程序，而这伴随流产的风险。事实上，当分析基因组的蛋白质编码区时，只有28％不能丧失功能的基因具有与人类疾病表型相关的已知功能，甚至更少的基因在产前具有表型。

许多对人类发育至关重要的基因尚未得到科学发现，出生缺陷和复发性流产的原因在很多时候是未知的，因此许多家庭对未来怀孕的复发风险存在很大的不确定性。而由于样本的选择偏倚，需要进行前瞻性研究以确定是否在更大的样本队列中观察到如此高的诊断率，随着有关产前WES诊断能力的更多信息，将该技术纳入临床实践的具体应用场景与策略需要进一步研究。

最大的挑战涉及变异的解读和测试前后的遗传咨询。在选择其他诊断方法无法获得诊断的产前病例中，提供WES可能是合适的。此类病例的实例包括使用核型和微阵列的标准基因检测是正常的，复发性或多发性先天性异常。产前WES在父母为近亲结婚或基因芯片显示胎儿为UPD时也是合适的。如果胎儿呈现的疾病是高度遗传异质性的，WES也可能比使用靶向PANEL测序更具成本效益。