洛哌丁胺对结核分枝杆菌 牛分枝杆菌 地霉和蒙脱石有直接杀菌作用

尽管抗生素的有效性和广泛使用的疫苗接种，结核病（TB）仍然是一个全球性的健康威胁，这将导致全球有9只万人死亡，通常与营养不良，糖尿病和HIV感染（Ozer等人，2017年）。主要关注的问题之一是耐药菌株的出现。在TB中观察到的药物抗性与中断处理和抗生素滥用相关联（Johnston等人。2009年）。另一个问题是治疗的持续时间。对药物敏感的TB化疗需要至少6个月（Ozer等人。2017年）。耐药结核病和广泛耐药结核病的治疗方案包括价格昂贵，活性低，毒性高的二线药物。口服和胃肠外给药途径必须管理，对于长达24个月（Ma等人。2010 ;Yuen等人，2015年）。此外，在全球范围内，由NTB引起的肺部疾病的发病率有所增加，并且大多数NTB对一线结核病药物都有抗药性。

重新使用FDA批准的药物是应对结核病治疗挑战的替代方法，尤其是作为宿主指导的治疗方法。盐酸洛哌丁胺是苯基哌啶衍生物，是高度亲脂性的外周作用μ阿片受体激动剂，通常用于治疗感染性和非感染性急性和慢性腹泻（Baker 2007；Regnard等。2011）。洛哌丁胺是一种有效的免疫调节剂。它减少的细胞内生长的结核分枝杆菌H37Rv的在人类和小鼠肺泡巨噬细胞在体外通过调节产生TNF-&α;和抗微生物肽的诱导自噬（Juárez等人。2016，2018）。此外，洛哌丁胺对海洋污染细菌和金黄色葡萄球菌具有直接的杀菌活性，对卡氏棘阿米巴和棘阿米巴菌的致病菌株具有抗寄生虫活性（Chai等人。2014 ;Ryu等。2016 ; Baig等。2017）。在这里，研究旨在确定洛哌丁胺的抗菌活性是否直接与某些分枝杆菌接触后发生。

结核病治疗中的当前挑战促使人们开发具有新颖作用方式的新型抗结核药，这些新型药物可缩短治疗或降低目前临床结核病药物的毒性。重新使用FDA批准的药物也可以提供替代方法。此外，NTB误导了诊断，无法进行有效的治疗。NTB的治疗困难，漫长，昂贵且费时（Ryu等人，2016年）。

此研究使用REMA测定法确定了洛哌丁胺对分枝杆菌种类的杀菌作用（图 S1）。实验者观察到不同浓度的洛哌丁胺会抑制所有评估的分枝杆菌物种的生长。结核分枝杆菌H37Ra株和耻垢分枝杆菌是易受<100  μ克毫升-1，而牛分枝杆菌BCG和结核分枝terrae易受到<150  μ克毫升-1。两种大肠杆菌（ATCC 25922和43895）都对洛哌丁胺不敏感，即使在2000μg ml -1时也是如此。 μg ml -1的氨苄西林足以杀死它们。同时也观察到的金黄色葡萄球菌也易受洛哌丁胺，但在较高浓度下（<250  μ克毫升-1）。

图一 洛哌丁胺对分枝杆菌生长的影响。非结核分枝杆菌（a）土分枝杆菌和（b）耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌，（c）结核分枝杆菌H37 Ra，（d）Rv和（e）牛分枝杆菌BCG。一式三份地列举了CFU。描述了四个孤立实验的均值±SD，* P  <0·05

图二 洛哌丁胺对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌生长的影响。革兰氏阴性细菌：（a）大肠杆菌ATCC 25922，（b）大肠杆菌ATCC 43895和革兰氏阳性细菌：（c）金黄色葡萄球菌。将CFU重复三次。描述了四个孤立实验的均值±SD，* P  <0·05

*最小抑菌浓度。

洛哌丁胺的分枝杆菌杀菌作用通过CFU分析进行了定量（图 1）。我们观察到洛哌丁胺显着抑制了这项研究中测试的分枝杆菌的生长。测试的分枝杆菌物种的最小抑菌浓度（MIC）是从100至150  μ克毫升-1。相比之下，大肠杆菌菌株对洛哌丁胺不敏感，在浓度> 2000μg ml -1时，其生长仅减少90–95％  （图 2a，b）。金黄色葡萄球菌对洛哌丁胺的浓度依赖性很强，但杀死分枝杆菌所需的浓度是三倍以上。2c）。在这些测定中使用的浓度（<1·25％）的DMSO存在下，未观察到抑制作用。表1展示出了每种菌株的MIC。

盐酸洛哌丁胺是电流携带钾通道和电压依赖性和非依赖性钙通道，其主要目标是哺乳动物细胞的一种有效的阻断剂（Hillier等人。2011 ;Klein等人。2016）。此前的研究证明洛哌丁胺的直接杀灭微生物的作用（Chai等人。2014 ;Baker等人。2017年）。在本研究中，我们调查了洛哌丁胺是否将分枝杆菌靶向直接杀伤。我们发现洛哌丁胺能够抑制结核分枝杆菌（如结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的BCG）的生长，并且都能缓慢生长（有报道称它们会引起肺部疾病（T. M. terrae）和快速增长的（M. smegmatis）非结核分枝杆菌（Driks等人，2011；Henkle and Winthrop 2015）。由于这些抑制性质，洛哌丁胺可以以NTB治疗被认为是，因为这些分枝杆菌是（霍斯拉维用来对抗结核病最一线抗生素抗性Khosravi等人。2018）。尽管MIC可能很高，但我们发现洛哌丁胺能够以非常低的浓度（12·5和18· 7μg ml -1）显着抑制所有菌株的分枝杆菌生长。 ），这表明洛哌丁胺的治疗价值可单独或与常规化疗联用进行研究。

洛哌丁胺具有类似于基于哌啶醇分子（PIPD1），这是MmpL3蛋白的强效抑制剂，参与分枝菌酸的出口转运体（Dupont 等人。2016）。因此，可以认为洛哌丁胺具有类似于PIPD1的作用机理。这两个分子都是亲脂性物质，它们可以通过到达周质空间并结合MmpL3来破坏霉菌酸的合成。后者是，事实上，认为与抵抗活性的化合物的推定靶的结核分枝杆菌或NTB（Li等人。2019）。

与抗分枝杆菌活性相反，洛哌丁胺未能以我们体外系统可能的最高浓度杀死大肠杆菌。这种不同的杀菌活性可能与洛哌丁胺的高度亲脂性的（Mazzoni等人。2006年）。洛哌丁胺可能结合霉菌酸并穿透分枝杆菌细胞壁，其脂类含量高于大肠杆菌（E. coli），后者的细胞壁富含脂多糖（LPS）。LPS形成不可渗透的屏障，可防止小的疏水性化合物（如抗生素和清洁剂）进入（Nikaido 2003）。这一事实可能使大肠杆菌在高浓度洛哌丁胺（2000μg ml -1）下存活 。

研究发现，洛哌丁胺抑制生长的金黄色葡萄球菌在500 μ克毫升-1。苯哌啶衍生物类似于洛哌丁胺，已被证明可阻断金黄色葡萄球菌NorA（MFS型）和MepA（MATE型）外排泵的功能，而3-（2-芳基乙基）哌啶可杀死S.金黄色葡萄球菌在MIC值范围从62·5至500  μ克毫升-1。尽管这些浓度过高，但MIC的四分之一增加了抗生素的积累并增强了抗生素对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活性。表达的AcrAB（RND型）泵系统，由多达两倍减少抗生素的MIC（Kaatz等人。2003）。相同的能力增强的抗菌活性已被报道用于维拉帕米，它可以杀死指数增长，固定相，和非复制的结核分枝杆菌H37Rv的在200的MIC  μ克毫升-1并增强抗微生物的常规抗生素活性的调节剂量（Gupta等人。2013 ;Chen等人。2018）。为了确定洛哌丁胺是否能杀死非复制性结核分枝杆菌，有必要进行进一步的研究 以及使用洛哌丁胺作为辅助疗法是否会降低抗结核药的MIC。

在以往的研究表明，洛哌丁胺增加巨噬细胞的能力，以消除细菌感染，同时降低与防止由加剧炎症组织损伤的潜在促炎性细胞因子（Juárez 等人。2016）。此外，抗微生物肽的洛哌丁胺诱发μ阿片受体依赖性诱导和TNF&α;产生的感染人类巨噬细胞的减少的结核分枝杆菌或耻垢分枝杆菌（Juárez 等人。2018）。

此次研究表明，洛哌丁胺杀死结核分枝杆菌，耻垢分枝杆菌，牛分枝杆菌和分支杆菌以适合于人类使用浓度。此外，这一发现支持其潜在用途，可作为治疗结核或NTB菌株感染的一部分。

论文链接：

https://doi.org/10.1111/lam.13432