自然杀伤细胞免疫检查点抑制剂在癌症治疗中的研究进展

摘要

近年来许多研究证实免疫检查点抑制剂在多种癌症治疗中的潜力。自然杀伤细胞（natural 致命物 cell，NK）是固有免疫系统的重要组成部分，在肿瘤免疫监视中发挥重要作用。其作用效应依赖于其与抑制和（或）激动受体的结合，无需主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）便能有效杀伤肿瘤。NK细胞对实体和血液肿瘤有巨大的杀伤潜力，已被越来越多的研究证实是肿瘤免疫治疗的理想靶点。NK细胞上一些新发现的免疫检查点受体被证实在肿瘤微环境中介导NK细胞的功能障碍，是理想的肿瘤免疫治疗靶点。本文将重点论述近年来新发现的免疫检查点受体在调节NK细胞功能中的作用及其在肿瘤免疫治疗中的潜在应用。

概述

自然杀伤细胞（natural 致命物 cell，NK）是具有直接杀伤效应的一类固有淋巴样细胞，在监视和控制肿瘤中起着重要作用。在肿瘤早期，NK细胞无需预刺激即可选择性杀伤癌变过程中的异常细胞；不受主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）限制。然而，许多癌症患者中存在NK细胞功能失调，使得肿瘤细胞得以逃脱NK细胞的免疫监视。因此，恢复癌症患者的NK细胞功能有望成为一种新的免疫治疗方法。

近年研究发现许多新的NK细胞免疫检查点分子，如非人白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-Ⅰ类特异性抑制受体（如PD-1、TIGIT、CD96、TIM-3）和激动受体（如NKG2D），其可控制肿瘤微环境中NK细胞的功能障碍[1-2]。此外，NK细胞还表达HLA-Ⅰ类特异性抑制受体（如NKG2A和LAG-3）及激动受体（如CD226），其通过“故障保险（fail-safe）”机制控制NK细胞杀伤健康细胞[1]。此类NK细胞受体介导多种信号传递，而信号的平衡关系决定了NK细胞是杀伤靶细胞（如应激细胞和肿瘤细胞），还是保持非活化状态。信号的调节异常导致NK细胞功能障碍，在某些癌症中存在NK激动受体表达下调和抑制受体表达上调，如在骨髓瘤中NK细胞表达的CD226水平下降[3]、PD-1水平上调[4]。NK细胞免疫检查点受体的信号调节异常使NK细胞出现功能异常。由此可见，阻断这些免疫检查点分子尤其是抑制受体的调控是改善NK细胞功能的重要策略。此外多项临床研究已证实，这些免疫检查点分子抑制剂对不同类型癌症有临床疗效，如抗PD-1抗体pidilizumab能增强人NK细胞对自体多发性骨髓瘤细胞的杀伤活性[4]。本文就一些具有发展前景的NK细胞免疫检查点及其在癌症免疫治疗中的应用进展进行综述。

01
PD-1

程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）又称CD279，属于免疫球蛋白超家族，其存在于T细胞及NK细胞中，是一种重要的免疫抑制分子。PD-1在原发性间皮瘤和转移性肿瘤（包括肺癌、肠腺癌、子宫癌、乳腺癌和膀胱癌）恶性胸水中的NK细胞上均有表达[5]，在三阴性乳腺癌的CD56dimCD16dim/−NK细胞上表达水平增加。

PD-1与其配体PD-L1和PD-L2结合，介导包括NK细胞在内的免疫细胞失活。如体外实验中对放疗耐受的非小细胞肺癌通过自身高表达PD-L1和诱导NK细胞增加PD-1表达，逃逸NK细胞的免疫监视[6]；而在小鼠淋巴瘤肿瘤模型中，PD-1通过抑制NK细胞的免疫监视，促进肿瘤细胞从NK细胞应答中逃逸[7]。PD-1的免疫受体酪氨酸抑制基序（Y248）与蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2相互作用抑制了包括ZAP70、PI3K/AKT、C3G及ERK在内的近端信号分子，进而抑制免疫细胞的活化[8]。此外，富组氨酸糖蛋白可通过抗C型凝集素样受体1B调控PD-1的表达，从而增强NK细胞活性[9]。上述研究或许能阐明包括卡波西肉瘤患者的外周血、消化道肿瘤患者的外周血中的NK细胞及肿瘤浸润的NK细胞中PD-1表达水平上调的机制[10-11]。

PD-1在阻断治疗肿瘤的临床前研究及临床试验取得了瞩目成就。pidilizumab是近年投入临床试验的一种抗PD-1单克隆抗体，能阻断多发性骨髓瘤患者NK细胞的PD-1/PD-L1通路，从而增强NK细胞对自体细胞的杀伤活性[4]。而靶向NK细胞的PD-1阻断免疫治疗，如NK细胞联合PD-1抗体（sintilimab和pembrolizumab）治疗晚期非小细胞肺癌（NCT03958097）和晚期胆管癌（NCT03937895）的Ⅰ/Ⅱ期临床试验正在进行中。此外，高密度活化的人原始NK细胞可杀伤3D培养中不依赖PD-L1表达的结直肠癌细胞，提示异体基因激活的NK细胞可能是治疗此类癌症的有效方法[12]。而IFN-β和抗PD-1联合、以及抗EGFR和抗PD-1的联合治疗可以分别增强NK细胞对鼻咽癌和头颈部肿瘤细胞的细胞毒性[13-14]。

02
TIGIT、CD96和CD226

T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域[T cell immunoreceptor with Ig and immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif（ITIM）domains，TIGIT]又称WUCAM或Vstm3，是一种抑制T细胞及NK细胞活化的免疫检查点分子，由IgV结构域、1型跨膜结构域、ITIM和免疫球蛋白酪氨酸尾部基序（immunoglobulin tail tyrosine，ITT）构成。其中ITT与ITIM类似于细胞质尾部的基序，而ITT样基序在抑制信号通路中起重要作用[15]。在肿瘤免疫监视中，TIGIT的作用与PD-1/PD-L1轴在肿瘤免疫抑制作用类似，此外，其在NK细胞的活化和成熟中起重要作用[15]。

1）TIGIT与脊髓灰质炎病毒受体（poliovirus receptor，PVR）及脊髓灰质炎病毒受体相关分子2（poliovirus receptor-like 2，PVRL2）（又称CD112、Nectin-2或PRR2）的相互作用可直接抑制NK细胞毒性。2）TIGIT因其与DNAX辅助分子1（DNAX accessory molecule-1，DNAM- 1）竞争结合Nectin样配体而具有免疫抑制作用。TIGIT的主要配体如CD155，在多种类型的癌细胞中均有表达。TIGIT与CD155的结合促进了Src家族激酶Fyn和Lck的磷酸化，使得SHIP-1募集，进而下调了调节免疫细胞功能的P13K、MAPK、NF-kB信号通路[15-16]。TIGIT与CD155的结合可以防止人NK细胞毒性和细胞因子的产生，通过平衡DNAM-1介导的激活而实现，这种激活可通过抗体介导的TIGIT阻断进行逆转[17-18]。

阻断TIGIT使得NK细胞能够抵抗来自骨髓抑制细胞的抑制[19]。下调TIGIT表达则可抑制结直肠癌细胞的增殖[20]。在某些特定的临床前期肿瘤模型中，TIGIT的阻断能调节细胞的效应功能，提示可能对癌症患者有治疗作用。此外，TIGIT的表达与结直肠癌的进展显著相关，说明TIGIT可以作为评估癌症的生物学标志或预后标志物[21]。

CD96又称TACTILE，为免疫球蛋白基因超家族的成员之一，是一种在静息NK细胞上表达的抑制型免疫受体[17, 22]。CD96可在免疫应答过程中促进NK细胞和T细胞的黏附。CD96与TIGIT类似，与DNAM-1竞争结合Nectin和类Nectin配体并抑制NK细胞活性。CD96与CD155的结合可抑制NK细胞产生IFN-γ。在肺转移性肿瘤小鼠模型中，抗体介导的CD96阻断可促进NK细胞产生IFN-γ并改善对癌症的控制[23]。另有研究指出，在小鼠肿瘤模型中抗CD96抗体无需阻断CD96-CD155的相互作用便可促进NK细胞的抗肿瘤转移活性[24]。尽管有研究指出肝细胞癌患者的CD96与NK细胞的耗竭相关[25]，抗体介导的CD96阻断对NK细胞功能的影响及其在癌症患者中的作用仍有待进一步研究。此外，CD96的阳性表达可能与急性白血病的原发耐药或复发进展相关[26]，说明CD96也许可成为判断急性白血病患者预后的相关指标。

CD226又称PTA-1或DNAM-1，属于免疫球蛋白超家族，是一种在NK细胞上表达的免疫激动受体。其细胞外部分含有2个类Ig的结构域，其细胞质尾部包含3个酪氨酸残基。通过与PVR、Nectin-2、CD96和TIGIT相互作用调节NK细胞功能[27-28]。如在小鼠模型中，CD96可以抑制CD226的抗肿瘤功能，进而促进肺转移及肿瘤生长[23]。

03
TIM-3

T细胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白-3（T cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecule 3，TIM-3）是TIM家族成员。在结构上，TIM-3的细胞外区由1个单个膜结合的远端IgV结构域及1个邻近膜的可变长度的糖基化黏蛋白区组成，其细胞内区由1个C端细胞质尾部和5个保守的酪氨酸残基组成，这些残基可与T细胞受体复合体的多种成分相互作用，其中Y256和Y263用于传递信号，而信号的调节通过与HLA-B相关转录物-3（HLA-B associated transcript 3，Bat3）相互作用完成[29]。在稳定状态下，Bat3与TIM-3结合从而募集Lck，Lck具有催化活性并且促进T细胞信号传导；TIM-3与同源配体结合后，Y256和Y263磷酸化导致Bat3游离，反而拮抗T细胞的抑制[29]。TIM- 3在几乎所有成熟的CD56dimCD16+NK细胞上均有表达，并且在IL-12联合IL-18或者IL-15联合IL-12刺激成熟后表达上调，说明TIM-3可作为NK细胞成熟或活化的标志，并且TIM-3与抗体联合可以抑制NK细胞介导的细胞毒性[15]。目前有研究指出，TIM-3通过干扰PI3K信号通路阻碍NK细胞的肿瘤免疫监视，导致肿瘤浸润的NK细胞功能异常，从而促进肝细胞癌的生长[30]。

04
LAG-3

淋巴细胞活化基因-3分子（lymphocyte activation gene-3，LAG-3）又称CD223，在T细胞和NK细胞上均有表达。LAG-3结构上与CD4相似，但与CD4相比，其与MHC-Ⅱ类分子有更高的亲和力。LAG-3另一种可能的配体是LSECtin，为DCSIGN家族中的一员[15]。LAG-3的细胞质尾部由3个在人类及小鼠中均为独特且保守的区域组成，包括丝氨酸磷酸化位点、重复的EP序列及保守的KIEELE基序，其中KIEELE基序具有抑制CD4+细胞上的LAG-3的功能。值得注意的是，LAG-3参与抑制T细胞功能并导致其耗竭，协同阻断LAG-3和PD-1可以恢复T细胞功能。有研究表明，LAG-3缺陷小鼠的NK细胞在杀伤特定癌细胞方面存在缺陷[31]；而使用LAG-3抗体甚至是可溶性LAG-3阻断LAG-3通路则对人NK细胞的细胞毒性无任何影响。但由于LAG-3具有激活T细胞和NK细胞的潜力，仍有希望成为一个有效的免疫治疗靶点。

05
NKG2家族受体

5.1 NKG2A

人自然杀伤细胞家族2成员A[NK group 2（NKG2）family of receptor A，NKG2A]是NKG家族中的NK细胞受体，与CD94二聚体结合，形成与C型凝集素相关的抑制受体并识别HLA-E，这类抑制受体与靶细胞上的MHC-Ⅰ类配体相互作用，导致颗粒极化的完全抑制及细胞毒性颗粒的释放[15, 32]。在结构上，NKG2A的细胞质尾部含有2个ITIM，这些ITIM与ITIM结合受体连接后被磷酸化，从而导致酪氨酸磷酸酶（如SHP-1、SHP-2）的募集，被募集的SHP-1能阻断NK细胞的大多数下游信号。SHP-1选择性地去磷酸化Vav1，从而抑制NK细胞毒性，而在NKG2A与HLA-E连接后，Crk的磷酸化抑制了NK细胞[32]。

阻断抑制性NKG2A受体可增强肿瘤免疫反应。一项研究表明通过将蛋白滞留于内质网可有效抑制NK细胞上表达的NKG2A，而这种缺乏NKG2A表达的NK细胞在急性髓细胞白血病患者的骨髓标本中表现出较强细胞毒性[33]。在临床方面，monalizumab靶向NKG2A已被证实可以破坏NKG2A与HLA-I之间的相互作用，从而释放模拟“missing-self”应答的抗肿瘤NK细胞毒性[34]。一项Ⅱ期临床研究数据显示，抗NKG2A联合西妥昔单抗治疗头颈部鳞癌，约31%患者出现部分缓解[34]。monalizumab目前正在投入Ⅰ/Ⅱ期临床试验，包括部分血液及实体肿瘤的单药治疗或联合其他免疫检查点阻断治疗（NCT02671435和NCT02643550）[32]。

5.2 NKG2D

NK2组家族受体D[NK group 2（NKG2）family of receptor D，NKG2D]可引发细胞毒性，是一种在NK细胞上表达的免疫激动受体，其属于C型凝集素样受体的CD94/NKG2家族[35]。NKG2D与肿瘤细胞表面的配体结合，从而使NK细胞激活并摧毁肿瘤细胞和细胞因子的产生。肿瘤细胞通过脱落可溶性NKG2D配体逃逸免疫监视，因此靶向NKG2D可能是一种可行的肿瘤免疫治疗方法[36]，如多种恶性肿瘤细胞（黑色素瘤、白血病）中均有高表达的NKG2D可溶性MIC配体，是一种潜在的治疗靶点。

06
其他免疫检查点受体

其他共刺激通路参与调节NK细胞应答，这些应答可阻止癌症进展，有助于癌症的免疫治疗。如杀伤性免疫球蛋白样受体（致命物 immunoglobulin-like receptor，KIR）是一种在NK细胞上表达的受体，分为抑制型和激动型。研究表明，抑制受体KIR与靶细胞MHC-Ⅰ类分子之间缺乏匹配/识别会激活NK细胞活性，导致对靶细胞的排斥，为KIR的阻断刺激NK细胞抗肿瘤活性的治疗方法奠定了基础[37]。在临床试验中，KIR和PD-1联合阻断治疗晚期头颈部肿瘤患者的客观有效率有升高趋势（NCT01714739），KIR与5-氮杂胞苷（5-azacytidine）的联合阻断治疗复发性或难治性急性髓细胞白血病的患者中，25例患者有5例对治疗有反应，其中2例患者完全缓解（NCT02399917）[38]。此外，关于KIR单独或联合阻断治疗（NCT02481297、NCT02599649、NCT02252263）的临床试验正在进行中，以上研究均解释了KIR阻断在肿瘤免疫治疗中的潜力。

07
结语

NK细胞在肿瘤监视和控制中起重要作用。激活NK细胞功能和增殖NK细胞或许是一种可行的肿瘤免疫治疗方法。如前所述，NK细胞上的激动受体和抑制受体间的信号平衡可抑制NK细胞的细胞毒性，防止正常细胞被NK细胞杀伤。而在肿瘤微环境中，细胞毒性颗粒和细胞因子等刺激增加NK细胞的抑制受体表达的同时，也增加了其在癌细胞上的配体，反之激动受体在NK细胞上的表达减少的同时，也减少了其在癌细胞上的配体。因此，抑制信号和激活信号的失衡会导致NK细胞的功能障碍，从而抑制细胞因子的分泌和肿瘤细胞的杀伤，最终启动了肿瘤的免疫逃逸。由此可见，靶向共刺激受体信号通路或许可以成为一种增强NK功能的替代方法来治疗癌症。有研究还发现一些其他增强NK细胞对癌症反应性的方法，如靶向肿瘤微环境中特定的免疫抑制机制。另外，某些联合阻断免疫检查点分子的方法，如NKG2A和PD-1/PD-L1轴可以增强NK细胞毒性，从而增强临床疗效。此外，NK细胞治疗癌症（如非霍奇金淋巴瘤）可以作为治疗化疗耐药患者的解决方案，并在临床试验中得到证明[39]。综上所述，NK细胞免疫检查点分子作为一种有前景的治疗靶点，深入了解其功能有助于开发针对难治性癌症的新治疗方法。同时也需要对这些靶向免疫检查点药物的安全性、耐受性以及临床疗效等进一步研究。