原因不明复发性流产的诊治

我国《复发性流产诊治的专家共识》定义复发性流产（recurrentspontaneous abortion，RSA）为发生3次或3次以上妊娠未满28周的胎儿丢失。在育龄期女性中的发生率为1%～5%，严重影响育龄期女性的身心健康，是临床亟待攻关的疑难问题之一。
RSA病因复杂多样，包括已知的遗传、解剖、内分泌、感染、免疫因素和血栓前状态。此外，仍约50%的患者病因不明，因为原因不明，所以治疗缺乏循证依据，且多数治疗存在较大争议。在我国原因不明RSA（unexplained recurrent spontaneousabortion，URSA）也被称为“同种免疫型RSA”，认为其与母胎免疫耐受失衡有关，建议临床病因筛查中，排除各种非免疫因素和自身免疫因素后的不明原因RSA，应当考虑是否与同种免疫有关。国际上一般将排除各种已知病因的RSA称之为URSA，认为与免疫耐受失调有关。由此可见，国内外对URSA的定义还存在差异，病因筛查的广度和深度也各异，这可能是导致URSA的临床研究结果出现较高异质性的重要原因之一。近年来随着对疾病研究的深入，越来越多既往未被认识的致病因素得以发现和确认，真正意义上URSA的比例将逐渐缩小。

1 病因学研究
尽管我们对熟知的自身免疫、易栓症、内分泌、解剖、感染等RSA相关病因都有不少新的发现，但RSA是一个多因素、多阶段的复杂生物学过程，涉及基因、蛋白质和代谢水平等多方面的改变，方法学上的最新进展有助于确认过去未曾明确的危险因素，可为解释和阐明RSA的病理机制提供新的线索。
1.1 未明确的遗传因素遗传因素一直被认为是RSA的病因之一，包括染色体异常、染色体多态性和基因异常。染色体异常包括夫妇和胚胎染色体异常，2%～5%的RSA夫妇双方或一方存在染色体异常，或在自然流产中，约一半以上的胚胎染色体存在异常，这些异常多数表现为染色体的结构和数目异常。
既往应用染色体核型条带技术检测，受技术条件限制会出现漏诊的可能性。采用高通量测序技术，如二代测序（next generation sequencing，NGS）对样本DNA进行低深度全基因组测序（copy number variationsequencing，CNV-seq），与核型分析相比可额外多检出1%的明确致病性CNV。全外显子组测序（Wholeexome sequencing，WES）可捕获全基因组范围内编码区及剪接位点在内的所有遗传变异。Qiao等对4对复发性流产夫妇外周血DNA和他们的7例核型正常的胎儿绒毛组织DNA进行WES测序，发现其中两个家系的胎盘绒毛组织中分别携带DYNC2H1基因和ALOX1基因的复合杂合突变，复合杂合突变分别来自各家系中的父母。Suzuki等对来自两个患有RSA的伊朗近亲婚配家系的流产组织DNA进行WES测序，鉴定出这两个家系均有NOP14基因纯合突变。Quintero-Ronderos等对49例无血缘关系的RSA病例进行WES测序，41%的患者中发现分布有22个基因的27个潜在有害基因变异，这些基因分布于与胚胎植入和妊娠维持密切相关的不同分子生物学通路中。
除了染色体异常外，基因异常（多数为单核苷酸多态性）与URSA具有一定相关性，认为RSA具有遗传易感性。目前，报道较多的遗传性易栓症相关基因、载脂蛋白E（ApoE）、雌激素受体α（ERα）内含子1区、黄体酮受体等位基因片段多态性、免疫相关基因多态性包括HLA，Foxp3，IL-10，IL-18等。
1.2 未明确的免疫因素研究认为，近半数的RSA与免疫功能紊乱有关，分为自身免疫型RSA和同种免疫型RSA。同种免疫紊乱包括固有免疫紊乱和获得性免疫紊乱。同种免疫紊乱与RSA的关系仍处于研究阶段，在我国称之为URSA。获得性免疫紊乱包括：封闭抗体缺乏、T/B淋巴细胞异常和细胞因子异常等。固有免疫紊乱包括：自然杀伤（NK）细胞数量及活性升高、巨噬细胞功能异常、树突状细胞功能异常和补体系统异常等。
1.2.1 获得性免疫紊乱 T细胞经诱导分化成不同的亚群，例如Th1、Th2、Th9、Th17、Th22和滤泡Th细胞（Tfh），这些亚群在整个妊娠过程中都具有重要作用。CD4+/CD8+比值异常、CD4+T细胞中Th1/Th2平衡向Th1偏离、调节性T细胞（Treg）数量和免疫抑制功能的下降、Th17和Treg比例失衡等均与RSA有关。Th9细胞分泌IL-9为Th2细胞的一个亚群，但在表型和功能上都不同于Th2细胞，受过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）转录调控。在孕鼠分娩过程中见蜕膜Th9细胞和IL-6下降，在人类生殖中的作用尚不明确。Th22细胞具有较强的可塑性，可分别诱导分化成Th1和Th2，通过分泌IL-22发挥生物学作用，在母胎界面IL-22有利于滋养细胞增殖活性，抑制细胞调亡，保护滋养细胞免于病原体损伤等作用。URSA患者绒毛组织中IL-22受体（IL-2R）表达减低。Tfh细胞辅助B细胞参与体液免疫，有利于妊娠期间Th1/Th2平衡维持，过度增加或缺少均可能导致流产。
B细胞通过产生特异性抗体或多种细胞因子上调免疫反应，也可作为专职抗原呈递细胞参与免疫应答。CD5+B细胞（B-1）是产生自身抗体介导自身免疫病的主要B细胞亚群。B细胞还可以极化成两类效应细胞Be-1和Be-2，分泌不同的细胞因子谱参与调节Th1/Th2平衡。在外周血和子宫内膜/蜕膜中均发现一群调节性B细胞（Breg）存在，分泌IL-10和IL-35发挥负向免疫调节作用。与正常妊娠小鼠相比，自然流产小鼠体内Breg数量下降。当Breg过继输注给流产小鼠时，小鼠体内的Tregs数量相应增加，避免了免疫排斥反应、有利于妊娠的维持。一项研究发现RSA患者体内Breg 数量和IL-10水平均低于对照组。
滋养细胞、蜕膜和母体免疫细胞之间的分子对话通过细胞因子和趋化因子网络介导，目的是精确调控胚胎着床和正常妊娠维持。多数研究表明，RSA患者外周血和子宫内膜/蜕膜中细胞因子和趋化因子的表达谱较正常人发生了变化，但结果并不完全一致。一方面，无论是在外周血和子宫内膜中，细胞因子网络都比较复杂，且在妊娠期又会发生显著的变化，因此，很难确定所有参与RSA的细胞因子种类，更无法确定每种特定物质的相对重要性。其次，很难确定这些因子的特定细胞来源，可能由多种免疫细胞和非免疫细胞分泌。再次，外周血和子宫局部组织中的细胞因子表达格局并不完全一致。最后，由于细胞/组织制备或分离的方法学差异，以及检测技术的不同造成结果非标准化，容易导致理解上的混乱。
1.2.2 固有免疫紊乱 NK细胞在外周血（pbNK），子宫内膜（uNK）和蜕膜（dNK）中的表型和功能不完全相同。一般认为，pbNK细胞数量及活性增高与RSA有关，降低NK细胞数量，抑制其活性，有利于妊娠，pbNK细胞异常增高再次流产的风险增加。与pbNK杀伤肿瘤和清除病体功能不同，uNK在正常母胎界面却主要发挥促进血管重铸，维持免疫微环境稳定，促进胎儿成长等功能。URSA患者子宫内膜细胞毒性CD16+uNK增加，NKp46、NKp44和NKp30细胞毒性受体表达水平高于对照组。约60%的dNK表面表达Tim-3，Tim-3+dNK细胞高表达IL-4，低表达TNF-α和穿孔素，参与母胎免疫耐受形成。RSA患者Tim-3+dNK细胞比例下降，分泌Th1型细胞因子占优势。
蜕膜巨噬细胞（dMФ）约占蜕膜免疫细胞的20%，仅次于dNK细胞（70%），整个妊娠期间dMФ数量相对恒定。MФ根据表型和功能分成M1和M2两个亚群，正常妊娠中以M2极化的免疫抑制表型占优势，参与清除凋亡细胞和组织重塑，在母胎界面免疫耐受中发挥重要作用。在一些病理妊娠中，M1极化的促炎症表型细胞数量上升，对胚胎发育不利甚至导致流产。
蜕膜树突状细胞（dDC）占蜕膜免疫细胞的1%～2%，是功能强大的抗原呈递细胞，分成熟型（CD83+），未成熟型（CD209+）和介于两者之间呈激活状态但未成熟型（DEC-205+），具有免疫激活与免疫耐受的双重功能。在转基因小鼠模型中，缺乏dDC会破坏胚胎着床并导致胚胎吸收。人体研究表明：RSA外周血中成熟型DC细胞水平升高，未成熟型DC细胞数量降低；RSA患者蜕膜和胎盘中成熟型uDC细胞增多，未成熟型uDC减少；RSA妇女外周血和子宫内膜中免疫球蛋白样转录子4（ILT4）耐受性DC细胞下调。
中性粒细胞在整个人类妊娠期间母胎界面均可见，数量维持相对恒定，仅在分娩前细胞密度开始急速增加，于分娩期间数量达到最高值。在自然流产、子痫前期患者的蜕膜中均发现中性粒细胞聚集和异常激活，通过激活补体，形成中性粒细胞外诱捕网（NET）等多种机制发挥抗感染和细胞毒性双重作用。
1.2.3 单细胞测序单细胞转录组学（Single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）为探索细胞遗传和功能异质性、重建进化谱系以及检测稀有细胞亚群提供了强有力的工具。利用scRNA-seq技术研究人蜕膜、胎盘和绒毛组织，有助于揭示母胎界面微环境形成，并发现新的细胞亚群，这对于剖析RSA发病机制提供了极大的便利。Vento-Tormo等研究孕早期蜕膜和胎盘单细胞水平转录组谱，证实蜕膜基质细胞和dNK分别可再细分为表型和功能各异的3个亚群；展示了滋养层细胞分化为绒毛合体滋养层细胞（参与营养交换）或EVT（入侵并重塑螺旋动脉）的分化轨迹；预测了存在蜕膜和绒毛之间大量的受体-配体相关作用，有助于揭示母胎交互调控细胞增殖分化的分子机制。另一项关于人类早孕蜕膜和绒毛的单细胞研究详细展示了绒毛和蜕膜组织中每种细胞基因特征和相对比例，以及关键转录因子（TFs），大量表达的受体和配体等信息。将绒毛和蜕膜中的静止和高度增殖的亚型区分出来，发现成纤维细胞新的亚型。将scRNA-seq与质谱流式等技术相结合，可以从基因和蛋白等多个水平揭示免疫和非免疫细胞在妊娠过程的演变，为URSA极具应用前景的研究方向。
1.3 未明确的感染因素任何能够造成菌血症或病毒血症的严重感染均可以导致偶发性流产，然而生殖道各种病原体感染，以及TORCH感染与RSA的发生虽有一定相关性，但不一定存在因果关系。细菌性阴道病是晚期流产及早产的高危因素，但与早期流产的关系仍不明确。
越来越多的证据表明，慢性子宫内膜炎（chronic endometritis，CE）可能与RSA有关，目前CE尚无确切统一的定义。子宫内膜的持续性炎症，临床表现不典型，易被忽视。研究表明，CE在总人群中患病率为0.8%～19%，而RSA女性CE的患病率为10%～27%。一项纳入142例URSA患者和154例健康生育女性的病例对照研究中，通过宫腔镜检查发现67.6%URSA患者诊断为CE，健康生育女性CE阳性率为27.3%；通过病理学检查发现42.9%的URSA患者诊断为CE，健康生育女性CE阳性率为18.2%。
2017年欧洲人类生殖与胚胎学学会（ESHRE）指南提出，建议对RSA患者孕前行内膜活检明确是否存在CE。宫腔镜检查与子宫内膜免疫组织学相结合是诊断CE的推荐组合。但关于CE的诊断标准仍存在分歧，特征性CE诊断中宫腔镜检查结果包括局部或弥漫性子宫内膜充血、间质水肿、微小息肉。子宫内膜免疫组织化学提示浆细胞（CD138）的存在，常见表现为浅表基质水肿、基质密度增加、淋巴细胞和浆细胞主导的多行性基质炎性浸润，但目前关于组织切片中浆细胞的数量尚无统一的标准。所以，明确CE是否是URSA的感染因素之一，不仅需要更多临床数据验证，同时还要明确CE的诊断标准和临床定义。
1.4 未明确的内分泌因素 RSA公认的内分泌疾病因素主要包括甲状腺功能异常、黄体功能不全、高泌乳素血症、多囊卵巢综合征（PCOS）、糖尿病等。英国皇家妇产科学会（RCOG）认为，虽然PCOS导致RSA的机制尚不完全明确，但PCOS可增加自然流产的发生率。高胰岛素血症或胰岛素抵抗是PCOS主要的内分泌紊乱特征之一。研究认为，胰岛素抵抗可孤立于PCOS存在，胰岛素抵抗与RSA有关，是PCOS外引起RSA的孤立危险因素。胰岛素抵抗是代谢综合征、糖尿病和动脉粥样硬化的共同病理生理改变基础。研究证实，严重的胰岛素抵抗可以导致排卵异常，子宫内膜容受性降低，纤溶异常，胚胎供血不足，从而导致自然流产；胰岛素抵抗若未及时纠正，妊娠期糖尿病、高血压风险增加，甚至导致早产风险增高。但上述研究样本量比较局限，因此，胰岛素抵抗作为RSA未明确的内分泌病因之一，仍然需随机对照研究来提供循证医学依据。

2 治疗现状及进展
2.1 胚胎植入前遗传学筛查和URSA 鉴于胎儿染色体异常是URSA主要原因之一，在胚胎植入前通过植入前遗传学筛查（preimplantation genetic screening，PGS）选择染色体正常胚胎进行移植，可以提高胚胎着床率、妊娠率、降低早期流产发生率。尽管缺乏确凿的RCT证据认为URSA患者可以通过PGS获益。然而，一项由来自欧洲和美国的PGS专家组成的最新调查显示，各个中心对于RSA和反复移植失败的患者倾向于选择PGS。目前，非侵入性PGS技术正迅猛发展，如基因组学、代谢组学、表观遗传学和线粒体功能测试。随着技术的不断进步，效率的提高，以及成本的降低，PGS可能会帮助提高URSA患者的妊娠成功率。
2.2 孕酮和URSA 孕激素对维持正常妊娠至关重要，孕酮能否降低URSA患者的流产率，文献报道不一。一项多中心、前瞻、随机安慰剂对照研究发现早孕期使用孕酮不能改善URSA患者的活产率。而另外一项纳入8项双盲安慰剂对照研究的Meta分析提示，给予URSA患者孕激素支持可以有效降低流产率，且对母胎安全。孕激素似乎对治疗URSA有益，但何时开始使用，治疗持续时间，使用剂量，以及使用哪种给药途径等都有待进一步研究。
2.3 抗凝治疗小剂量阿司匹林（LDA）、低分子肝素（LMWH）和两者联合用于治疗URSA。但RCT结果显示，单独使用LDA或单独使用LMWH，或两者联合应用并不能改善URSA患者的活产率。
2.4 免疫调节治疗目前，出现很多针对免疫因素和URSA的免疫调节疗法，但相关的治疗均为试验性或经验性治疗，需要权衡利弊，用药前充分知情告知患者可能存在的风险。
合成皮质类固醇由于其对Th1/Th2型细胞因子和NK细胞的免疫抑制作用，被作为一种潜在的治疗方法，其中泼尼松龙可有效减少RSA患者uNK细胞数量，在该类患者中使用最广泛。但孕早期皮质类固醇治疗的安全性有待研究，其使用会导致早产、孕妇高血压和糖尿病的风险增加，安全剂量使用才能降低胎儿致畸风险。
在URSA患者中使用丈夫淋巴细胞进行主动免疫治疗，或第三方供体的白细胞或早期胚胎衍生物免疫治疗，一直颇受争议，因为存在血源性感染风险可能。但部分研究发现，正确使用主动免疫在URSA患者中会起到较好的治疗效果，特别是筛选接受治疗患者的标准，治疗后对免疫指标变化的监测非常重要。Liu等在2015年的Meta分析中，纳入18项共1738例URSA患者的随机对照研究，739例接受主动免疫治疗，999例接受生理盐水或自体淋巴细胞对照治疗，与对照组相比主动免疫治疗显著提高患者活产率（OR=3.74，95%CI 3.07～4.57），亚组分析发现，孕前和孕期续贯治疗活产率高于仅在孕前治疗（OR=4.67，95%CI 3.70～5.90 vs. OR=2.0，95%CI 1.39～2.88）。
丙种免疫球蛋白（IVIG）静脉滴注也称之为被动免疫，能降低细胞毒性T细胞毒性和数量、增加免疫抑制功能T细胞功能和数量、降低NK细胞数量和毒性，调节细胞因子的平衡，控制免疫炎症等。研究认为，IVIG治疗对于NK细胞数量和毒性增高、Th17/Foxp3+比例增高、Th1/Th2型细胞因子比值异常的RSA患者可以提高活产率。对于非免疫异常因素的RSA患者，综合多项研究的Meta分析证实使用IVIG并不能改善活产率，但在亚组分析中发现孕前使用IVIG组的活产率要显著高于胚胎植入后使用IVIG组。
TNF-α可能通过血栓和炎性因子参与妊娠丢失的发生过程。TNF-α拮抗剂（如阿达木单抗）目前被用于治疗URSA患者。一项对75例的回顾性研究表明，与单独使用抗凝剂相比，将阿达木单抗和IVIG的组合加入抗凝剂后可以改善活产率。但是目前缺乏前瞻性研究，并且妊娠期间使用TNF-α拮抗剂的安全性有待探究。
用作肠胃外营养的脂肪乳剂，在体外和动物研究中均显示具有免疫调节特性，并且它们通过抑制NK细胞活性发挥作用。只有一项小型随机试验显示出脂肪乳与IVIG治疗相当的妊娠率，仍需更多研究评估疗效和安全性。
蜕膜细胞产生粒细胞集落刺激因子（G-CSF），它是一种刺激嗜中性粒细胞增殖和分化的细胞因子。研究表明，它对动物的滋养细胞增殖和抗流产具有积极的作用。一项RCT研究发现，接受G-CSF治疗的URSA患者的活产率明显提高，没有严重的副反应，但建议在临床实践中使用G-CSF之前，需要进行较大的多中心试验。
综上所述，复发性流产病因复杂多样，有些患者可能是单一因素，也可能是多种因素并存，还有更多未知的病因，大多缺乏特异性临床表现，临床处理较为棘手。因此，深入研究复发性流产的未知发病原因和致病机制，对临床上探索新的具有循证医学基础的治疗方法、改善女性生殖健康有着积极的推动作用（参考文献略）