反复胚胎植入失败和流产与子宫内膜免疫因素

辅助生殖技术的发展使不孕患者的临床妊娠率极大提高，但仍有部分患者在多次移植优质胚胎后仍未获得临床妊娠。目前，对于反复种植失败（RIF）的定义国内外尚无统一标准，现在每个周期只移植1～2个高级别胚胎已逐渐成为趋势，因此，RIF主要指移植次数≥3次（新鲜或冷冻周期）或移植优质胚胎数≥4枚仍未获妊娠者。RIF已经成为阻碍妊娠率进一步提高的瓶颈问题，是生殖医学领域普遍存在的难题和研究热点。如何提高种植率已成为改善体外受精-胚胎移植（IVF-ET）结局的重要问题。RIF病因复杂，包括胚胎缺陷因素、子宫内膜容受性下降和混合因素。其中导致子宫内膜容受性下降的因素包括宫腔异常、薄型子宫内膜、黏附分子表达异常、免疫因素和血栓形成倾向等。研究表明，免疫系统是建立容受性和促成妊娠的关键，母体子宫内膜免疫细胞和细胞因子形成的微环境可影响子宫内膜容受性，调节蜕膜化反应、胚胎黏附、滋养细胞侵入、血管重构和免疫耐受，是胚胎生存和植入能力的重要决定因素。大量证据显示子宫内膜免疫功能紊乱可降低子宫内膜容受性，改变种植窗口期的子宫内膜基因谱，导致RIF。复发性流产（RSA）通常指发生2次或2次以上的妊娠24周前（我国为28周）的妊娠失败。RSA病因复杂，除遗传性/基因因素、内分泌因素、易栓症、感染和解剖性等原因外，免疫因素是十分重要的病因，约80%原因不明的RSA与免疫因素紧密相关。

RIF和RSA给病患带来较大的经济负担，并对患病夫妻造成极大的身心创伤，因而受到学界越来越多的关注。为了进一步加深我们对相关问题的理解，共同探索RIF和RSA的发病机制并寻找更为有效的治疗方法，本文将目前对RIF和RSA的子宫内膜免疫因素的认识加以整理分析。

1  子宫内膜免疫细胞参与RIF和RSA

胎儿来源的滋养细胞与母体免疫细胞之间存在精细而复杂的交互对话。母胎界面的免疫细胞以蜕膜NK细胞（dNK）数量最多，其次为巨噬细胞（MФ）、T细胞、树突状细胞（DCs）等。这些免疫细胞在调节子宫内膜容受性以及滋养细胞功能中均发挥不可或缺的重要作用，其数量和功能需要维持在适度范围内，内膜/蜕膜中异常的免疫反应包括低反应性和免疫过度活化都会导致RIF和RSA的发生。

1.1    NK细胞    蜕膜免疫细胞约70%是NK细胞，蜕膜中存在大量具有耐受表型（CD56^brightCD16^-）的dNK细胞，能够抑制细胞毒T细胞的损伤反应，促进子宫内膜血管重塑，有利于滋养细胞生长及向子宫肌层的适度侵袭，为胚胎植入、维持健康妊娠提供了有利的微环境。子宫自然杀伤细胞（uNK）数量和功能异常与子宫内膜发育延迟、不孕和RSA有关。围种植期子宫内膜中uNK的丰度可在临床中作为预测IVF-ET移植成功率的标志物。RIF患者的子宫内膜中具有异常水平和功能的uNK细胞。RSA患者具有更多的CD56^dimdNK细胞数目及明显下降的耐受型Tim-3⁺dNK细胞的比率，dNK细胞的胚胎毒性增加，促增殖和促血管形成能力受损。

1.2    MФ    MФ占蜕膜白细胞的15%～20%。在胚泡未着床期，dMФ向M1型偏移，滋养细胞向子宫侵袭之后向M1/M2型偏移，胎盘形成后dMФ向M2表型转变，从而保护胎儿和胎盘直到分娩。dMФ通过分泌多种细胞因子促进子宫内膜容受性、子宫螺旋动脉重塑、滋养细胞侵袭、胚胎黏附和种植。蜕膜耐受型的M2型MФ抑制了对胚胎抗原的免疫反应，吞噬凋亡滋养细胞防止释放炎性产物，抑制dNK的细胞毒性，从而创造耐受的免疫微环境。MФ分泌的炎性因子可抑制孕激素受体表达，影响蜕膜化进程和孕卵着床，参与RIF发生。RSA患者蜕膜中M1型MФ数目增加，M2型MФ数目下降，表明过多的M1型MФ诱导了母胎界面炎性微环境。多种分子机制如Tim-3/Galecin-9及透明质酸（HA）/CD44参与了dMФ M1/M2型之间的转变。dMФ的自噬也与不明原因RSA的发生相关。而多能细胞间充质干细胞（MSCs）能够通过抑制CD4⁺T的增殖和促进dMФ向M2型转变预防流产模型小鼠的胚胎丢失。

1.3    DCs细胞    蜕膜中1%～2%的免疫细胞是DCs。蜕膜DCs参与了子宫内膜蜕膜化和免疫耐受微环境的形成，也能够影响滋养细胞的侵袭和迁移。蜕膜中耐受型的DCs能够抑制T细胞的活化和增殖，促进调节性T细胞（Treg）的产生，通过调节黏附分子的表达影响子宫内膜容受性，参与囊胚定位和黏附。RSA患者蜕膜基质中具有较高的成熟DCs（mDCs）和较低的不成熟DCs（imDCs）。DCs异常低表达吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）也与不明原因RSA相关。

1.4    T细胞    T细胞占蜕膜白细胞的5%～15%。CD4+ T细胞亚群在母胎免疫耐受中发挥重要的调节作用，naïve CD4+ T细胞可分化为Th1、Th2、Th17和CD4+CD25+ Treg细胞，通过多种途径发挥不同的生物学功能从而维持免疫平衡，Th1/Th2/Th17/Treg比例失衡将影响母-胎免疫耐受，是不明原因RSA的重要原因之一。

1.4.1    Th1/Th2细胞    妊娠早期母-胎界面Th1/Th2细胞的平衡决定着妊娠结局，正常妊娠中蜕膜免疫反应向Th2型偏移，而向Th1型偏移或Th1/Th2增大则与妊娠失败相关，如RIF、RSA和早产。RIF妇女子宫内膜中Th1型细胞因子高表达可引起细胞凋亡，对胚胎种植产生不利影响，导致RIF发生。RSA患者围着床期子宫内膜及蜕膜中Th1型细胞的比率及Th1型细胞因子均较正常妊娠者明显升高。成功妊娠者蜕膜IL-22⁺IL-4⁺CD4⁺T细胞具有明显优势，而在RSA患者，IL-22⁺IL-4^-CD4⁺T细胞更多见。

1.4.2    Treg细胞    妊娠后，母胎界面存在大量Treg细胞的募集、诱导和增殖，从而抑制母体对胎儿的特异性和非特异性的淋巴细胞免疫反应。Treg也参与胎盘血管重铸，增加滋养细胞侵袭力。Treg细胞的数量和功能与RIF和RSA有关。子宫内膜组织中Treg的免疫抑制功能下降，外周血中Treg的数量降低，与RIF发生有关。Treg也可作为一个标志物来帮助预测妊娠女性的流产风险。

1.4.3    CD8⁺T细胞    蜕膜中Tim-3⁺PD-1⁺CD8⁺T细胞能识别表达在滋养细胞上的PD-L1，产生抑制信号，从而诱导滋养细胞抗原特异性耐受。滋养细胞进而以人类白细胞抗原（HLA）-C依赖性的方式富集Tim-3⁺PD-1⁺CD8⁺T细胞。而蜕膜浸润、聚集、活化的胎儿特异性CD8⁺T细胞可致胚胎吸收/流产。

1.4.4    Th17细胞    Th17细胞具有很强的促炎作用，不明原因RSA患者蜕膜组织中Th17细胞特征性的细胞因子IL-17水平显著升高，胚胎着床部位以Th17/Th1细胞占优势。Th17/Treg的免疫失衡也参与RSA的发生。

1.4.5    &γ;&δ; Τ细胞    妊娠后蜕膜&γ;&δ; Τ细胞（d&γ;&δ; T）数目迅速增加，d&γ;&δ;T细胞促进了滋养细胞的增殖和侵袭，抑制了滋养细胞的凋亡，参与母胎界面Th2型免疫优势形成，在成功妊娠中发挥重要作用。而不明原因RSA患者可因耐受型d&γ;&δ; Τ细胞的减少或功能异常导致妊娠失败。

2 RIF和RSA子宫内膜免疫学异常的临床治疗

目前，RIF和RSA子宫内膜免疫学异常的临床治疗方法主要包括：甾体激素内分泌治疗，淋巴细胞主动免疫治疗，环孢霉素（CsA），免疫抑制剂泼尼松和他克莫司、被动免疫治疗如静脉注射免疫球蛋白（IVIG）等、其他免疫调节方法如粒细胞集落刺激因子（G-CSF）皮下注射和宫腔灌注疗法，子宫腔内注入人外周血单核细胞（PBMC）疗法，还有低分子肝素抗凝+阿司匹林抗血小板疗法等。上述疗法虽然有报道称能改善RIF和不明原因RSA的结局，但似乎都缺乏大样本RCT研究的循证医学证据支持。

2.1    改善子宫内膜免疫学异常的RIF女性妊娠结局的治疗    为了改善RIF患者的胚胎植入成功率，近些年采取了多种治疗措施，如甾体激素内分泌治疗、给予G-CSF宫腔灌注、淋巴细胞免疫治疗、子宫腔内注入PBMC、CsA、泼尼松和他克莫司、IVIG、抗生素治疗、脂肪乳、低分子肝素和阿司匹林以及机械性内膜损伤等疗法。有报道这些治疗方案可能通过改变子宫内膜局部的基因表达和蜕膜化，提高RIF患者的种植率，但这些方法应用的适应证、剂量、疗程以及疗效等尚无大样本的RCT研究支持。

移植后应用孕激素发挥其黄体支持及改善子宫内膜容受性的作用已成为IVF-ET常规的治疗方案，但不同患者对孕激素的敏感度以及RIF患者存在的其他影响子宫内膜容受性的因素将很大程度上限制孕激素的治疗效果。除了内分泌作用，孕激素也能够影响母体免疫系统，抑制NK细胞活性，诱导Th2型细胞因子。雌激素也能够降低促炎细胞因子的产生。黄体支持和雌激素的抗炎作用可用于内膜免疫过度活化的RIF患者。

对于子宫内膜免疫反应不活跃的RIF患者可给予G-CSF宫腔灌注免疫激活治疗。G-CSF对胚胎种植有积极影响，经阴道灌注或皮下注射G-CSF可明显改善RIF患者子宫内膜容受性，提高临床妊娠率，且对于薄型子宫内膜的RIF患者可明显增加子宫内膜厚度。G-CSF宫腔灌注后诱导白细胞产生的多种细胞因子如LIF、胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）和IGF-Ⅱ等，在维持胚胎发育，保护胚胎免受应激和凋亡中起到重要作用，可能是其作用机制之一。

部分RIF患者子宫内膜存在Th1/Th2型免疫失衡，对这部分RIF病患进行淋巴细胞免疫治疗后，可诱导Th2型免疫偏移及NK细胞活性改变，为胚胎植入提供合适的免疫微环境，提高妊娠率。新鲜胚胎移植前3 d宫腔内注射培养的自体外周血PBMC可以显著增加RIF患者的植入率、临床妊娠率及活产率，对于子宫内膜薄的妇女也适用。这种治疗方法的作用机制可能是：PBMC诱导内膜分化促进了胚胎黏附和侵袭，改善了子宫内膜的容受性。

慢性子宫内膜炎在RIF患者发生率高达14%～66%，虽然临床常无症状，但慢性子宫内膜炎常与不孕，RIF和RSA相关。慢性子宫内膜炎可导致内膜细胞因子表达异常，蜕膜化受损，内膜中过多的免疫细胞与下降的子宫内膜容受性和复发性妊娠失败相关。抗炎治疗可以改善伴有慢性子宫内膜炎患者的IVF-ET妊娠结局。

我们团队多年的临床及实验室研究发现，对于RIF患者，在严格排除禁忌证并选择合适适应证［主要包括：细胞免疫或（和）体液免疫功能紊乱，健康状况良好，符合RIF病史，夫妇染色体核型正常或行三代IVF-ET术的夫妇，宫腔形态正常，病毒学检测阴性，ABO血型抗体＜1∶128，Rh正常］的基础上，采用CsA在IVF-ET胚胎移植后进行治疗，可通过影响胚胎滋养细胞的生物学功能改善妊娠结局，显著提高RIF患者胚胎种植率和活产率。虽然我们的研究已取得了一定进展，但仍需进一步大样本的RCT研究以证实其疗效，对于CsA在改善滋养细胞功能及子宫内膜容受性中所发挥的作用仍有待进一步解析。泼尼松龙可用于伴有内膜免疫过度激活的RIF患者的治疗。研究显示，泼尼松龙能够降低Th1型细胞因子，促进Th2型细胞因子的表达。对有RIF病史和高Th1/Th2比率的患者使用他克莫司也可提高妊娠成功率。IVIG用于NK细胞异常的RIF患者，能明显提高妊娠率和活产率。脂肪乳因能抑制NK的细胞毒效应，发挥免疫调节和抑炎作用，也被用来治疗NK细胞异常的RIF患者。对于内膜免疫活性低下（NK细胞数量减少，炎性因子水平下降）的RIF病患，可采用内膜搔刮术或在黄体期开始隔日注射hCG的方法。对于部分不明原因的RIF患者临床上有采用低分子肝素+阿司匹林治疗，也有部分患者获得成功，具体机制仍有待解析，可能与低分子肝素和阿司匹林改善子宫内膜局部微循环的作用有关。到目前为止，泼尼松龙、IVIG、脂肪乳、子宫内膜搔刮等方法用于治疗RIF远未达成共识，需要进一步大样本、多中心的RCT研究证实。

2.2    子宫内膜免疫学异常的RSA患者的改善与治疗    近年来，RSA尤其是不明原因RSA的高发病率以及治疗方法存在的局限性、安全性和有效性争议的问题等，促使其治疗方案得到不断的发展和完善。虽然有研究表明，某些治疗方案能够改善RSA的再次妊娠结局，但目前临床上使用的绝大部分疗法的疗效仍未得到证实，甚至有相互矛盾的研究结果。因此，针对子宫内膜免疫学异常或母胎免疫耐受失衡的RSA患者的个体化、特异性治疗方案的发展仍有较长的路要走。目前，通过调节子宫内膜免疫因素治疗RSA的方法主要包括：甾体激素内分泌治疗、淋巴细胞主动免疫治疗、IVIG、CsA、免疫调节剂泼尼松/强的松和他克莫司等。

研究发现，孕激素具有对Th1/Th2细胞的免疫调节效应，可用于Th1/Th2细胞因子失衡的RSA患者的治疗。有关淋巴细胞主动免疫治疗母胎免疫耐受失衡的RSA患者的疗效仍存在争议，尚未达成共识。IVIG可用于治疗免疫紊乱的RSA和RIF患者，改善妊娠预后，对于具有异常细胞免疫反应包括NK细胞比率和细胞毒性或升高的Th1/Th2比率的患者尤为适用，能够降低NK细胞的比率和细胞毒性，诱导Th2型免疫偏移，增加Treg细胞数目，调节Treg/Th17细胞比率，中和细胞毒性抗体。有研究显示，IVIG疗效与患者既往流产次数和IVIG剂量有关。

我们课题组应用CsA治疗母体免疫紊乱引起的RSA已有多年的临床经验，虽然获得了多例临床成功案例，但仍然需要进一步开展大样本、多中心的RCT研究来进一步明确其有效性。我们的研究发现，CsA可通过调节母体免疫系统，平衡Th1/Th2型反应，诱导Treg细胞的扩增，诱导母体免疫系统对胎儿的耐受，同时促进胎儿健康生长，这些证据都值得研究者们进一步关注。强的松因能重构免疫稳态，促进Treg细胞的扩增和免疫抑制型细胞因子IL-10的表达，抑制促炎性Th17细胞的分化，也常用于不明原因RSA的治疗，但也缺乏高级别的研究证据支持其有效。RSA患者维生素D缺乏比较常见，而维生素D被认为在自身免疫和细胞免疫调节中具有重要作用，补充维生素D可通过诱导Th2型免疫，抑制Th1型免疫和NK细胞毒性发挥对免疫失衡型RSA的治疗作用。

3  结语

RIF和RSA是生殖医学领域亟待解决的难题。虽然RIF和RSA确切的发病机制仍不完全清楚，但已有的大量数据表明，子宫内膜免疫因素在RIF和RSA的发病中发挥重要作用。虽然相关研究已取得了一定进展，一些治疗方法也取得了一定的疗效，但迄今为止，尚缺乏针对这一群体的具有高级别循证医学证据的安全有效的治疗方案。因此，对RIF和RSA患者子宫内膜免疫因素发病机制的深入研究以期寻求更为安全有效且个体化的治疗方案，具有重要意义。