Nrf2激动剂干预肿瘤化疗药物毒性的研究进展
Nrf2激动剂干预肿瘤化疗药物毒性的研究进展
王婧亚1，阙琳玲2，何 柳1，贾兆君1，徐江丽1，余四旺1
Progress of researches on Nrf2 activators in intervention of tumor chemotherapy toxicities
WANG Jingya1, QUE Linling2, HE Liu1, JIA Zhaojun1, XU Jiangli1, YU Siwang1
作者单位
1. 北京大学药学院分子与细胞药理学系，北京100191；2. 南京医科大学附属无锡市人民医院药物临床试验机构，江苏 无锡 214023
基金项目
1. 国家自然科学基金（编号：81472657；81272468）
2. 中国博士后科学基金（编号：2018M641116）
AUTHORS FROM
1. Peking University School of Pharmaceutical Sciences, Department of Molecular and Cellular Pharmacology, Beijing 100191, China; 2. Drug Clinical Trial Institution, Wuxi People’s Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Wuxi 214023, Jiangsu Province, China
GRANT
1. National Natural Science Foundation of China（No. 81472657; 81272468）
2. China Postdoctoral Science Foundation（No. 2018M641116）
[摘要]
化疗是肿瘤治疗中最重要的手段之一，但其疗效和应用受限于肿瘤组织的耐药性及对正常组织的毒性。红系衍生的核因子2相关因子2（nuclear factor erythroid-derived 2-related factor 2，Nrf2）是调控细胞抗氧化响应和药物代谢的核心转录因子，当前针对其在肿瘤预防和放化疗耐受中的作用已有大量研究。然而，关于Nrf2在化疗药物对正常组织毒性中的作用和机制研究尚不够深入，其临床相关性有待进一步探究。本文将就Nrf2在常见化疗药物毒性中的作用进行综述，并重点讨论萝卜硫素、富马酸二甲酯和甲基巴多索隆等3种典型的Nrf2激动剂在干预肿瘤化疗药物常见毒性中的作用、机制以及可能的应用前景，以期促进对Nrf2在肿瘤化疗中作用的全面理解，并为今后相关的肿瘤化疗辅助用药的开发和临床应用提供理论依据。
[关键词]肿瘤；药物疗法；药物相关性副作用和不良反应；抗药性，肿瘤
[ABSTRACT]
Chemotherapy is one of the most important tumor therapies, but its efficacy and clinical applications are limited by chemoresistance of tumors and toxicities to normal tissues. Nuclear factor erythroid-derived 2-related factor 2（Nrf2） is a pivotal transcription factor that regulates cellular antioxidant response and drug metabolism, its roles in cancer chemoprevention and therapy resistance have been extensively investigated. However, the involvement of Nrf2 in chemotherapy toxicity remains to be explored, and its clinical significance deserves further investigation. In the present article, we will briefly review the known roles of Nrf2 in common toxicities of chemotherapy drugs, and summarize the application of sulforaphane, dimethyl fumarate and bardoxolone methyl in the intervention of chemotherapy toxicities. This review is expected to enhance a comprehensive understanding of the roles and mechanisms of Nrf2 in tumor chemotherapy, and to provide scientific rationale for the development and clinical application of chemotherapy-associatedcomplementary and alternative drugs.
[Key words]Neoplasms; Drug therapy; Drug-related side effects and adverse reactions; Drug resistance, neoplasm
近年来，尽管免疫疗法等新型疗法的研究进展十分迅速，但基于小分子抗肿瘤药物的化疗仍是临床上治疗恶性肿瘤的最主要手段之一。然而，化疗在临床上的应用仍存在诸多限制，尤其是肿瘤组织对药物的耐受即耐药性，以及正常组织对药物的不耐受即化疗毒性。肿瘤耐药性一直是抗肿瘤新药研发和化疗药物临床应用的关注热点，但当前研究者对化疗药物毒性的关注则相对不足。
红系衍生的核因子2相关因子2（nuclear factor erythroid-derived 2-related factor 2，Nrf2）是调控哺乳动物细胞抗氧化响应的核心转录因子，其调控着多个与氧化应激、药物转运、能量和物质代谢、线粒体功能和DNA损伤修复等功能相关基因的表达[1]，并在肿瘤的发生、发展和预防治疗中有着重要且复杂的两面性，其一方面具有保护正常细胞，减少氧化损伤和肿瘤发生的风险；另一方面则会保护肿瘤细胞，促进其存活、增殖和耐药[2-3]。肿瘤细胞中Nrf2高表达或Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）基因突变等因素导致的Nrf2激活促进肿瘤进展和导致化疗耐药已在基础和临床研究中被广泛证实。因此，寻找Nrf2抑制剂以逆转肿瘤耐药正成为新的研究热点[4]。
Nrf2在化疗药物毒性中的作用正逐渐引起研究者们的关注，目前的研究结果多为特定化合物可以减轻化疗药物的毒性，而激活Nrf2可能是作用机制之一。由于Nrf2在保护正常组织的同时有导致肿瘤耐药甚至进展的可能性，因此，这一方向的研究迄今仍未看到临床研究报道和明确的临床应用可能。本文将在简述Nrf2功能和调控机制研究的基础上，结合相关化疗药物毒性发生机制，总结Nrf2及其典型激动剂在化疗药物毒性中的作用，以期加深对化疗中Nrf2在肿瘤组织和正常组织中两面性作用的全面理解，从而推动Nrf2激动剂作为辅助药物改善化疗毒性的临床研究和转化应用。
1
Nrf2与化疗药物毒性
1.1
Nrf2信号调控
Nrf2是一个由NFE2L2基因编码的CNC碱性亮氨酸拉链（cap‘n’collar basic leucine zipper，CNC-bZip）家族转录激活因子，相对分子质量为6.6×104～6.8×104，包括7个Nrf2-ECH同源（Neh）结构域。Nrf2几乎在所有细胞类型中都有表达，主要调节细胞对氧化应激和亲电性外源物质刺激的转录反应[5]。在无刺激的情况下，Nrf2定位于细胞质中，并与Keap1蛋白结合，进而通过Keap1-E3泛素连接酶介导的泛素化和蛋白酶体降解，维持在较低水平。当受到氧化性或亲电性物质作用时，Keap1蛋白中特定半胱氨酸的自由巯基被修饰，发生构象改变导致Nrf2泛素化受到抑制；Nrf2从Keap1解离后转移至细胞核并与小Maf蛋白形成异二聚体，识别并结合启动子区域中抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE），诱导下游靶基因的表达[6]。此外，Nrf2的稳定性和活性还会受到蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）和糖原合成酶激酶-3&β;（glycogen synthesis kinase-3&β;，GSK-3&β;）等激酶磷酸化以及自噬等过程的调控，其详细机制已有大量研究和综述[7]。
1.2
化疗药物毒性
化疗的目的是尽可能选择性杀伤肿瘤细胞，但同时也会损伤药物相对富集、对药物敏感或增殖旺盛的正常组织，这就造成了化疗药物的毒性。这些组织和（或）器官包括造血组织、消化系统上皮组织、肝脏、肾脏、外周神经、心脏、肺、皮肤及黏膜和其他组织等[8]。化疗药物毒性往往会导致治疗剂量的减小和化疗时间的缩短，甚至提前终止治疗，严重降低了患者的生存质量，更可能引发系统性感染等并发症进而危及患者生命。
化疗药物毒性的机制有多种多样，氧化应激和线粒体损伤是最为常见的一种机制[9]。如蒽环类药物多柔比星（doxorubicin，DOX）可诱导氧化应激损伤心肌细胞，同时干扰线粒体生物合成与线粒体DNA复制，影响线粒体和细胞质内Ca2＋的稳态，导致细胞凋亡或坏死，进而引起进行性心脏纤维化，最终发展至心力衰竭[10]。氧化应激和线粒体损伤也是化疗药物导致神经[11]、肝[12]、肾[13]、肺[14]和骨髓[15]等组织损伤的重要机制。鉴于Nrf2在氧化应激、线粒体损伤以及药物代谢和转运中的重要作用[1, 5]，可以预期其对肿瘤化疗药物毒性可能有重要影响。
1.3
Nrf2对化疗毒性的影响
已有多项研究报道，Nrf2在一些常见化疗毒性中的作用。如经DOX处理后，小鼠心脏中Nrf2及其调控的抗氧化基因如血红素氧化酶（heme oxygenase-1，HO-1）和NAD（P）H醌氧化还原酶1[NAD（P）H : quinone oxidoreductase 1，NQO1] mRNA和蛋白水平显著增加。DOX在Nrf2基因敲除（Nrf2－/－）的小鼠中可导致更严重的心肌坏死，并伴随严重的氧化胁迫和自噬缺陷；与之相反，在心肌细胞中过表达Nrf2则可以减轻DOX导致的心脏毒性[16]。由于更严重的线粒体膜电位降低和细胞色素C释放，以及更多的活性氧（reactive oxygen species，ROS）升高和抗氧化能力降低，Nrf2－/－小鼠对奥沙利铂（oxaliplatin）导致的外周神经损伤、脂肪性肝炎和肝损伤更加敏感 [17-18]。顺铂可在野生型小鼠肾脏中诱导Nrf2依赖的细胞保护基因，如NQO1、HO-1和谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基（glutamate cysteine ligase catalytic 子单元，GCLC），以及多药耐药相关蛋白2（multidrug resistance-associated protein 2，MRP2）和MRP4等的表达，但在Nrf2－/－小鼠中其诱导作用缺失，同时会引起更严重的肾毒性，并伴随严重的氧化损伤和炎性反应[19]。此外，一些特定化合物或药物可以激活Nrf2并减轻化疗药物的毒性，这些研究一方面说明了Nrf2在化疗药物毒性中的作用，另一方面也为化疗药物毒性的干预提供了潜在的候选药物。
2
Nrf2激动剂与化疗药物毒性
当前已发现大量针对Nrf2的激动剂，并就其在肿瘤、神经退行性疾病和代谢性疾病等多种氧化应激相关疾病发生和防治中的作用进行了广泛且深入的研究[20]。这些Nrf2激动剂多为植物化学物质，并广泛存在于可食植物或膳食补充剂中，包括萝卜硫素（sulforaphane，SFN）、苯乙基异硫氰酸酯、奥替普拉、姜黄素、白藜芦醇、富马酸及其酯、齐墩果烷三萜及其合成衍生物甲基巴多索隆（bardoxolone methyl，CDDO-Me）等，其中的部分化合物已经进入人群研究或临床试验，甚至已作为治疗药物获得美国食品和药物管理局（Food and Drug Admistraton，FDA）批准。本文将重点讨论3种典型Nrf2激动剂[SFN、富马酸二甲酯（dimethyl fumarate，DMF）和CDDO-Me]在化疗药物毒性中的作用，尤其是在整体动物实验中的结果，并综合考虑其对肿瘤和正常组织的影响，以探究其临床应用的可能性。
2.1
SFN与化疗药物毒性
SFN是一种广泛存在于十字花科蔬菜中的异硫氰酸盐类植物化学物，通过修饰Keap1蛋白上特定的半胱氨酸残基来阻止Nrf2泛素化降解，进而激活Nrf2。SFN预防和协同治疗肿瘤的作用已受到了广泛关注和大量研究，其中已开展的临床试验的包括胶质瘤[21]、前列腺癌[22]、乳腺癌[23]和胰腺癌等。如服用富含SFN糖基化前体萝卜硫苷的花椰菜汤可以降低男性前列腺癌的进展风险[24]。此外，在一项针对胰腺导管腺癌晚期患者的随机双盲试验中发现，给予SFN能抑制肿瘤生长，且增加肿瘤的化疗敏感性[25]。
在体外实验中，SFN可预防DOX诱导的心肌细胞氧化胁迫，改善心肌细胞线粒体功能[26]；在整体动物水平，SFN可减轻DOX造成的大鼠与小鼠的心脏病变和功能障碍[27-28]。在原位大鼠乳腺癌模型中，SFN一方面恢复了心肌细胞中被DOX抑制的Nrf2信号，降低了DOX的心脏毒性，另一方面更加显著地抑制了肿瘤中Nrf2的活性，同时还促进癌细胞周期阻滞、增加DNA甲基化以及影响细胞线粒体活性，从而协同增强DOX的肿瘤杀伤作用[29]。另外，SFN可以激活Nrf2来减轻博莱霉素所致的肺泡细胞损伤和肺纤维化等肺部化疗毒性[30]。同样，SFN对奥沙利铂治疗引起的外周神经毒性也有预防和缓解的作用，通过激活Nrf2信号通路来减轻氧化应激并抑制瞬时受体电位蛋白家族表达，从而保护小鼠背根神经节神经元中线粒体功能[17]。上述研究为临床中进一步研究SFN在肿瘤尤其是乳腺癌化疗中的增效减毒作用提供了实验依据。事实上，SFN用于保护DOX所致心脏毒性的临床Ⅰ/Ⅱ期试验已于2019年底在美国开始招募受试者（NCT03934905）。
2.2
DMF与化疗药物毒性
富马酸又名反丁烯二酸或延胡索酸，是能量代谢中的重要中间代谢物，同时也是常见的工业原料。DMF和其代谢产物富马酸单甲酯（monomethyl fumarate，MMF）可激活Nrf2信号，上调抗氧化、抗炎性反应基因的表达，提高线粒体膜电位并改善线粒体功能，从而对中枢神经系统损伤产生保护作用[31]。DMF已于2013年被FDA批准用于治疗多发性硬化症，其应用于治疗多种肿瘤、炎性肠病和颅内出血等疾病的研究相继被报道[32-33]。此外，DMF在多项临床试验中被用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤（NCT02546440）、成人脑胶质瘤（NCT02337426）、慢性淋巴细胞白血病以及T小淋巴细胞淋巴瘤（NCT02784834）。
DMF与MMF可通过激活Nrf2来缓解奥沙利铂、顺铂和硼替佐米应用引起的PC12大鼠神经元样细胞和大鼠背根神经节神经元退行性病变，改善轴突损伤[34]。在小鼠结肠癌C26、人结肠癌HCT116、人胃腺癌MKN45和人胰腺癌MIA Paca-2等多种肿瘤细胞，以及C26小鼠移植瘤模型中，DMF可减轻奥沙利铂所致外周神经毒性，同时不会影响奥沙利铂的抗肿瘤活性[35]。DMF与维生素D的衍生物PRI-5202共同作用可激活维生素D受体和Nrf2抗氧化通路，诱导人早幼粒细胞白血病HL60细胞的分化，并在SCID/Beige免疫缺陷小鼠HL60细胞异种移植瘤模型中观察到协同抗肿瘤作用，且DMF不会增加血液毒性[36]。另有研究发现，DMF通过激活Nrf2可减少链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠心脏纤维化，以预防糖尿病心肌病的发生[37]，还能改善免疫抑制药物环孢霉素A引起的肾功能不全[38]和缓解大鼠肝脏缺血再灌注引起的肝脏损伤[39]。因此，DMF对化疗药物引起的心脏、肾脏和肝脏等靶器官毒性也可能有保护作用。鉴于DMF已经显示了良好的成药性和安全性，上述研究提示DMF具备在临床上用于防治化疗药物毒性尤其是奥沙利铂所致外周神经毒性的潜力。
2.3
CDDO-Me与化疗药物毒性
CDDO-Me由天然物质齐墩果酸经结构改造而来的，同样通过共价修饰Keap1蛋白来激活Nrf2介导的抗氧化信号通路，并抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等炎性反应信号转导[40]。最初CDDO-Me主要被研究用于肿瘤的预防和治疗，后来的研究结果发现CDDO-Me对肾脏氧化损伤有显著的保护作用，可以改善早期慢性肾病和Ⅱ型糖尿病患者的肾小球滤过率；但CDDO-Me用于治疗Ⅱ型糖尿病患者晚期慢性肾病的Ⅲ期临床试验（BEACON和NCT01351675），因更高的心血管不良反应发生率而提前终止[41]。目前，除在肾脏疾病中的应用，CDDO-Me对血液性疾病[42]和其他慢性疾病[43]的保护潜力也仍在研究中。
在一项用三维多细胞型心脏系统模拟DOX对患者心脏功能影响的研究中发现，CDDO-Me可以改善DOX引起的心脏毒性[44]。另外，CDDO-Me通过增强Nrf2活性来诱导解毒基因GCLC、NQO1和药物外排基因SLC47A1（solute carrier family 47 member 1，又称multi-drug and toxin extrusion protein 1，MATE1）的表达，从而改善顺铂引起的肾脏细胞损伤[45]。本课题组在前期研究中发现，环磷酰胺及其代谢产物丙烯醛在Nrf2－/－小鼠中可导致较野生型小鼠更严重的外周血单核细胞和粒细胞的减少，且在停药后Nrf2－/－小鼠骨髓细胞的再生能力的恢复相较野生组更慢，而CDDO-Me的干预可以显著减轻野生型小鼠中环磷酰胺诱导的骨髓抑制[46]。另外，用乙烯基氨基甲酸酯诱导肺肿瘤发病率较高的A/J小鼠形成自发性肺癌模型后，发现CDDO-Me与卡铂和紫杉醇等化疗药物联用可显著降低肿瘤负荷，抑制肿瘤的发生和发展，同时检测到CDDO-Me可以上调外周血单核细胞中NQO1 mRNA和蛋白的表达水平，从而改善卡铂和紫杉醇所导致的血液毒性等不良反应[47]。鉴于血液毒性的普遍性和重要性，外加临床取样的便利性，笔者认为检测外周血特定有核细胞Nrf2的水平，来考察其与特定化疗药物血液毒性的相关性，进而利用CDDO-Me等Nrf2激动剂进行干预，可能是临床上研究Nrf2与化疗药物毒性之间关系及其药物干预的合适切入点。
2.4
其他激动剂与化疗药物毒性
除上述典型的Nrf2激动剂外，还有许多天然物质可通过调节Nrf2通路对化疗药物毒性产生保护作用，同时不影响甚至增加化疗药物疗效。KHAN等[48]开发了一种顺铂联合Nrf2激动剂齐墩果酸的pH依赖型碳酸钙纳米系统，可以改善肝癌细胞对顺铂的耐药性，并通过激活Nrf2和抑制肝脏细胞色素P450同工酶2E1（细胞色素 P450 2E1，CYP2E1）来缓解顺铂造成的肝毒性。香菇多糖作为一种免疫增强剂，以依赖Nrf2的方式增加ARE下游NQO1和HO1抗氧化基因的表达，恢复DNA修复酶水平并抑制细胞凋亡相关基因的表达，从而减轻顺铂诱导的肾脏细胞损伤并改善小鼠的肾脏毒性，且体外实验证明香菇多糖不会影响顺铂的抗肿瘤活性[49]。同样的，伪人参皂苷（pseudoginsengenin DQ，PDQ）通过NAD＋依赖性组蛋白去乙酰化酶1（乙酰化酶 1，SIRT1）/NF-κB和半胱天冬酶信号通路间接激活Nrf2水平，对顺铂诱导的急性肾损伤产生保护作用，同时可增强顺铂在Lewis肺癌荷瘤小鼠中的抗肿瘤活性[50]。L-肌肽是一种天然二肽，存在于骨骼肌和心脏等器官中，可以减少糖基化蛋白质和清除细胞内毒素，在细胞抗氧化、抗衰老和神经保护上起到重要作用。在一项临床试验中，口服L-肌肽（500 mg/d）激活Nrf2信号并抑制NF-κB通路，能显著改善接受FOLFOX（奥沙利铂、5-氟尿嘧啶和四氢叶酸）方案化疗的结直肠癌患者外周神经毒性，提示在化疗中L-肌肽可用作化疗辅助剂减轻以外周神经毒性为主的化疗药物毒性[51]。这些研究同样说明了，Nrf2在改善化疗药物毒性中有重要作用，激活Nrf2可能成为一种有效的干预策略。
3
结语
研究显示，Nrf2不仅在肿瘤的发生、发展和耐药性中扮演了重要角色，其在化疗所造成的不良反应中的作用也引起了越来越多的注意。已有大量化合物被发现可以通过激活Nrf2来减轻化疗药物的毒性，但其临床应用的同时也需考虑药物对肿瘤和正常组织的影响，为此，其临床前研究应该在荷瘤动物中进行。从临床相关性的角度考量，现有的研究包括SFN抑制DOX在乳腺癌患者中的心脏毒性、DMF用于减轻奥沙利铂导致的外周神经毒性和CDDO-Me干预血液毒性等都具有临床转化的潜力，但Nrf2激动剂与化疗药物如何联用以及联用的安全性等问题还需进一步探究。化疗毒性无疑是阻碍化学治疗进展的一大因素，本研究介绍了部分Nrf2激动剂对改善化疗药物毒性的作用，希望能为肿瘤辅助治疗药物的开发带来新思路，进而实现增强化疗疗效以提高患者生存质量的愿望。
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