组蛋白甲基化修饰在多发性骨髓瘤发生发展中的作用研究进展

摘要

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一类骨髓浆细胞恶性克隆性疾病。尽管MM的治疗有所进展，但大部分患者均会复发或耐药，因此亟需新的治疗靶点。除了遗传缺陷和骨髓微环境紊乱外，越来越多的证据表明表观遗传学调控异常在MM发病中发挥重要作用。表观遗传因子的突变往往与基因组不稳定、耐药性和疾病进展有关，且这些突变在治疗后有所增加，尤其是组蛋白甲基化和DNA甲基化修饰酶。本文就组蛋白甲基化修饰在MM中的作用进行综述，重点讨论组蛋白甲基化转移酶（his?tone methyltransferases，HMTs）和组蛋白去甲基化酶（histone demethylases，HDMs）在MM发生发展中的作用。

前言

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是以终末分化的浆细胞克隆性增生为特征的血液系统恶性肿瘤，可引起全身多脏器功能损害，主要表现为骨质破坏、肾损害、贫血、高钙血症及感染等。虽然MM的治疗取得较大进展，患者生存期获得延长，但易复发且不可治愈。本文旨在探讨MM的发病机制、寻找更为有效的治疗靶点。

MM的生物学特性错综复杂，是一种异质性很强的血液系统肿瘤，多种因素共同参与MM的发生发展，主要包括遗传学异常[1]、骨髓微环境的改变[2-3]和表观遗传学异常[4]。近年研究显示，表观遗传学异常在MM发生和疾病演变过程中扮演重要角色，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA。组蛋白修饰包括组蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、类泛素化及瓜氨酸化。MM患者全基因测序结果显示，多种组蛋白甲基化酶发生突变，包括去甲基化酶UTX、甲基化酶MLL和MMSET[5-6]。上述发现为MM的联合化疗提供新的治疗靶点。组蛋白甲基化较为复杂，通常可发生在组蛋白N末端的赖氨酸（K）或精氨酸（R）残基上，其功能与位点（K或R）和甲基化程度（单、二或三甲基化）相关，如H3K4me3、H3K36me3、H3K79me3、H4R3me1和H4K20me1可激活相关基因转录，而H3K9me3和H3K27me3则抑制基因转录[7-8]。组蛋白甲基化过程由组蛋白甲基化转移酶（histone methyltransferases，HMTs）和组蛋白去甲基化酶（histone demethylases，HDMs）共同调节，从而调控下游基因表达。现将组蛋白甲基化调节酶及其在MM中的作用综述如下。

01      HMTs

目前，已知的赖氨酸甲基化转移酶（lysine methyltransferases，KMTs）超过30余种，分属KMT1~8个家族（表 1）。根据其结构特点分为两类，一类为含有SET结构域，另一类包含DOT1L结构域。精氨酸甲基化则主要由PRMTs（protein arginine methyltransferase）家族成员催化完成，PRMTs催化甲基基团从S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转移到蛋白质精氨酸胍基的氮原子上。主要有3个亚型：非对称精氨酸二甲基化（ω-NG，NG-asymmetric dimethylarginine，ADMA），对称精氨酸二甲基化（ω-NG，NG-symmetric dimethylarginine，SDAM）和精氨酸单甲基化（ω-NG-monomethylarginine，MMA）。目前，已知有9种PRTMs，分别为PRTM 1~9（表 1）。

表 1 HMTs及其作用位点

02       HDMs

组蛋白赖氨酸残基的去甲基化酶（histone lylsine demethylases，KDMs）分为两大类，一类为KDM1家族成员，主要依靠FAD为辅助因子完成去甲基化，如LSD1（lysinespecific histonedemethylase 1），以甲醛和非甲基化的赖氨酸残基为产物的去甲基化酶，可与co-REST、BHC80、HDAC1/2等蛋白形成复合物发挥作用，作用于H3K4me1/2；另一类家族成员则包含1个JMJC（Jumonji C）结构域，依赖于Fe（Ⅱ）和&α;-酮戊二酸为辅因子，可对H3K4、H3K9和H3K36等多个位点进行去甲基化作用。包括多个亚型（KDM2~7）（表 2）。目前，对精氨酸残基的去甲基化酶报道很少，有研究显示KDM家族的部分成员，如KDM3A和KDM6B，也可以在精氨酸残基去甲基化[9]。JMJD6（Jumonji domain-containing protein 6）为包含JMJC结构域的铁及2-酮戊二酸依赖的加双氧酶，可对H3R2、H4R3进行去甲基化。此外，组蛋白甲基化酶也会针对非组蛋白作用，从而影响重要的细胞信号通路，包括NF- κB、RAS通路、PI3K/Akt、Wnt/&β;-catenin、P53和ER&α;通路[10]。

表 2 KDMs及其作用位点

03        组蛋白甲基化在MM发生发展中的作用

3.1 甲基化转移酶

MMSET亦称为WHSC1/NSD2，是目前在MM中研究最多的HMTs。约15%~20%MM患者发生t（4；14）易位，导致IgH上MMSET和成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）过表达。t（4；14）易位患者无进展生存期（progression-free survival，PFS）和总生存率（overall survival，OS）显著缩短，但硼替佐米可克服这种不良预后[11]。MMSET主要催化H3K36双甲基化和H4K20的双、三甲基化。MM中MMSET过表达导致H3K36me2水平增高，引起癌基因转录激活，促进癌细胞增殖[12]，受影响的基因还包括细胞周期（如cyclin E2）、凋亡和P53通路（如BAX和Bcl2）、DNA修复（如ATM和GADD45A）和整合素介导的信号通路（如CDC42）[13]。既往研究报道MMSET还可以甲基化Aurora激酶A（AURKA）导致P53蛋白酶体降解，从而引起肿瘤细胞增殖[14]。MMSET亦可与表观遗传学的抑制物相互作用，如sin3a、HDAC1-2和H3K4去甲基化酶LSD1/KDM1A，形成转录抑制复合物。MMSET、KAP1和HDACs形成的复合物可通过抑制miR-126导致c-myc水平增高，刺激MM细胞增殖[15]。沉默MMSET后可导致MM细胞周期停滞，诱导凋亡[16]。

MMSET亦与耐药密切相关，使其成为一个潜在的治疗靶点。MMSET可调节干扰素调节因子4（interferon regulatory factor 4，IRF4）的表达，抑制该基因可增强硼替佐米疗效。MMSET高表达还使得DNA损伤修复增加，导致部分患者对DNA损伤类药物不敏感。临床上也观察到表达t（4；14）患者在应用DNA损伤类药物后（如马法兰）很快复发[17]。MMSET在高效的同源重组和非同源末端连接两种DNA修复过程中是必需的，体外使其沉默后可增加对化疗药物的敏感性[18]。最近通过高通量筛选，5种潜在的MMSET抑制物被鉴定筛选，但仍需进一步工作确定其在MM中的作用[19]。

EZH2为多疏抑制复合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）的催化亚基。其可催化H3K27me3，从而抑制靶基因转录，并参与调控细胞周期、细胞衰老、细胞分化等生理或病理过程[20]。近年EZH2成为MM中的研究热点，其在MM进展过程中上调，并与高危表型和不良预后相关[21]。EZH2过表达还与IL-6A、c-myc激活或miR26a下调相关。有研究通过全基因组测序详细阐释了MM中H3K27me3相关标志，发现了常见的激活（H3K4me3富集）和沉默（H3K27me3富集）的特殊靶基因，与疾病进展及不良预后相关[22]。应用EZH2特异性抑制剂UNC199和GSK343可重新激活参与分化、细胞周期和凋亡的相关基因起到抗MM作用。虽然有研究表明在MMSET高表达的MM细胞中EZH2抑制剂敏感性增强，但有研究[23]并未发现两者间存在关联，该结果尚需进一步研究。研究表明，UNC199还可通过影响miRNAs表达导致下游癌基因或活化因子下调[24]。EZH2也参与骨髓瘤骨病的发生发展。成骨前体细胞中转录抑制因子（growth factor independence 1，GFI1）介导的RUNX2沉默依赖于HDAC1、LSD1（KDM1A）和EZH2的募集[25]。这些研究成果提示其可能成为潜在的治疗靶点。多种EZH2抑制剂目前在实体肿瘤和淋巴瘤中已进入临床试验阶段，有单药应用亦有联合化疗方案。其中最具潜力的是tazemetostat/EPZ-6438，在淋巴瘤患者中观察到良好疗效，且不良反应较小[26]。而GSK2816126单药临床试验的结果欠佳，Ⅰ期临床试验入组复发的非霍奇金淋巴瘤、MM和实体肿瘤患者，起始剂量从50 mg开始，逐渐升至最大剂量3 000 mg。结果显示22例可评估的患者中，仅1例部分缓解和7例疾病稳定[27]。目前，已被中止试验。但相关生物标志物的鉴定可能会增加此类药物的临床疗效。Laurie等[28]发明一项基于基因表达的EZ评分体系，能够预测EZH抑制物在HMCL和初诊MM中的敏感性。

G9a和GLP属于Su（var）3-9家族，主要负责常染色质组蛋白H3K9位点的单、双及三甲基化进而抑制相关基因的转录。G9a与胚胎发育、肿瘤细胞生长、认知及适应性行为和脂肪形成等多种生物过程密切相关[29]。近期研究显示，GLP在冒烟型骨髓瘤患者中高表达[30]。在急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、淋巴瘤和MM细胞系中，应用siRNA技术或小分子抑制剂降低G9a表达可显著抑制瘤细胞生长，上述研究结果提示G9a/GLP可成为MM治疗潜在的新靶点。

KMT1/SUV39H1负责H3K9的三甲基化，在正常骨髓浆细胞和MM患者浆细胞中存在差异表达。H3K9甲基化是异染色质蛋白（heterochromatin protein1，HP1）染色区的停泊位点，在异染色质形成及基因转录调控中具有重要作用[31]。SUV39H1被发现可结合RUNX1的抑制区域。在MM中，高表达的SUV39H1与不良预后相关，敲除后导致增殖减低、凋亡增加、ROS过度产生和DNA损伤。SUV39H1抑制物chaetocin在人MM细胞系和原代细胞中具有抗瘤细胞作用[32]。

KTM2/MLL可催化H3K4甲基化，促进转录激活。MLL（mixed lineage leukemia）家族成员MLL1-5在7%MM患者中发生突变，但对患者的PFS和OS均无显著性影响[33]。

PRMT5可催化组蛋白和非组蛋白精氨酸残基的甲基化[34]。PRMT5参与分化、增殖、同源重组和细胞迁移，在多种血液系统肿瘤和实体肿瘤中被发现过表达[35]。PRMT5被发现在MM中上调，并与不良预后相关。应用siRNA敲低或抑制剂EPZ015666可在HMCL和原代细胞中抑制细胞周期，诱导凋亡。此外，口服的EPZ015666可在小鼠模型中有效降低瘤负荷。EPZ015666在淋巴瘤中可介导P53甲基化，但在MM中其甲基化并不依赖于P53[36]。相反，TRIM21被证实为PRMT5在MM中的结合物，导致经典NF-κB信号通路受抑，从而使IKK介导的自噬增强[37]。

PRMT4作为精氨酸甲基转移酶1（coactivitor-associated arginine methyltransferase1，CARM1）的辅助刺激因子，介导H3R2me2a、H3R17me2a、H3R26me2a和非组蛋白甲基化，从而促进转录。Drew等[38]首次验证EZM2302，一种选择性PRMT4抑制剂，体外具有抗MM作用。Nakayama等[39]也于体外证明另一个PRMT4特异性抑制剂TP-064在MM中的抗增殖作用。

3.2 去甲基化酶

KDM1A也称为LSD1，介导H3K4me1/2去甲基化，抑制转录。但在特定条件下，KDM1A也可去除H3K9单双甲基，导致转录激活。KDM1A还可与其他表观遗传学调控复合物，如NuRD、SIRT1、CoREST/HDAC、MMSET和SIN3A/HDAC联合作用[40]。此外，KDM1A还可抑制P53功能[41]。KDM1A在多种血液系统肿瘤和实体肿瘤中表达增高[42]，但KDM1A/LSD1在MM中的作用尚存争议。有研究发现症状型MM和浆细胞白血病（plasma cell leukemia，PCL）患者中LSD1的水平显著高于无进展MM患者，且E-钙黏附蛋白和波形纤维蛋白的水平降低；还可抑制破骨形成，增加MM细胞对HDAC抑制剂的敏感性；与MMSET形成抑制复合物，支持其在MM中的成瘤功能[43]。相反，Wei等[44]研究发现，KDM1A的种系突变会促进MM发展。此外，KDM1A在MM进展过程中下调，在MGUS和MM中KDM1A也低于正常浆细胞；KDM1A突变的细胞中富含myc基因。KDM1A的抑制剂GSK-LSD1在小鼠模型中可促进MGUS发展；抑制KDM1A还可促进U266和原代细胞增殖。KDM1A/LSD1在MM中的作用如何仍需进一步研究。

KDM3/JMJD1C赖氨酸去甲基化酶家族包括KDM3A、KDM3B和JMJD1C。正常情况下，KDM3A和KDM3B介导H3K9me1/2去甲基化，在精子发育、干细胞自我更新和脂肪生成中发挥作用[45]。Ohguchi等[46]研究发现，KDM3A-KLF2-IRF4轴在MM细胞存活中发挥重要作用。KDM3A水平在MGUS和MM患者中较正常对照增高，敲除KDM3A可起到抗MM效应，并发现KLF2（Krüppel- like factor 2）和IRF4下调。KLF2在支持正常的B细胞和浆细胞功能方面发挥作用。IRF4为浆细胞特异性转录因子，可促进浆细胞成熟，且为MM成瘤所必需[47]。有研究证实，KDM3A在慢性缺氧条件下培养的MM细胞中上调，敲除后可诱导细胞凋亡，进一步证实HIF1&α;介导的KDM3A上调可诱导长链非编码RNA MALAT1表达，进而上调糖酵解基因和抗凋亡途径，提示在MM进展过程中，MALAT表达亦上调[48]。结果表明，HIF1&α;-KDM3A-MALAT1在缺氧的MM细胞中为潜在的治疗靶点。上述研究结束均表明，KDM3A在MM中有促成瘤的作用，因此需寻找特异性抑制剂[49]。

KDM5（JARID1）家族（KDM5A-D）介导H3K4me1-3去甲基，其中对H3K4me3亲和力最高，可直接抑制转录，或与其他抑制因子协同作用。3个孤立的初诊MM患者队列的生存分析显示，KDM5B是预后不良的危险因素。全KDM5抑制剂KDOAM-25处理MM细胞系MM1s，发现G1期停滞，细胞存活减少，ChIP-sequencing分析显示H3K4三甲基化水平增高[50]。另一种KDM5抑制剂compound33已被鉴定，但尚未应用在MM中[51]。

KDM6A（UTX）和KDM6B（JMJD3）介导H3K27me2/3去甲基化。UTX通常与其他表观遗传调控因子共同作用，如HMTs MLL2/3和HATs P300/CBP，激活转录[52]。已在10%MM患者中发现UTX表达的突变缺失[53]。在髓外MM和PCL，UTX的突变率达到30%~40%。Ohguchi等[54]研究发现，沉默UTX可促进瘤细胞增殖、黏附性和致瘤性，还可以增强MM细胞对EZH2抑制剂的敏感性，主要与Bcl-6重激活、继发IRF4和c-myc抑制有关。表明EZH2抑制剂治疗存在UTX突变的患者具有临床意义。而KDM6B/JMJD3则相反，其在MM中高表达，缺失后则可诱导细胞凋亡。NF-κB信号通路可激活KDM6A，依次上调MAPK通路相关基因，包括ELK和FOS，从而促进瘤细胞存活。KDM6B介导的MAPK通路活化是非去甲基化依赖的。KDM6B被鉴定为一种抑癌基因，在17p13缺失的高危患者中与TP53协同作用[55]。上述研究结果均证实KDM6A可作为EZH2抑制的标志，而KDM6B则可能成为潜在的MM治疗靶点。GSK-J4为首个KDM6家族的小分子抑制剂，但其抑制效果与KDM5类似[56]。因此，有必要开发特异性的KDM6抑制剂。

04       结语

组蛋白甲基化过程在MM中发挥重要作用，与表位突变、基因组不稳定、MM进展、耐药性出现和短暂的PFS有关。深入研究组蛋白甲基化异常对MM发病机制的影响，有助于寻找新的治疗干预靶点。针对HMTs或HDMs的药物已被证明可改变表观遗传格局，诱导抑癌基因重新表达。但临床应用的一项重要限制为不良反应。此外，表观遗传靶向药物对正常细胞群的长期影响亟需进一步研究。该类药物未来将进入个体化治疗，新的生物标志物识别、新药开发及多药联合等均可提供临床指导。

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