生物标志物在消化道肿瘤免疫治疗的应用探索
2018年免疫元年的开始，正式拉开了免疫治疗在各个癌种的应用的大幕。目前免疫治疗的研究进展代表了多个肿瘤治疗的进展。随着免疫治疗在临床实践的应用开始广泛，各种临床试验的结果陆续公布，特别是今年美国临床肿瘤学会（ASCO）年会和欧洲肿瘤内科学会（ESMO）大会上消化道领域公布的重磅结果，应该是彻底改变了食管和胃癌治疗的格局。但是临床试验中及真实世界中并不是所有的患者都能从免疫治疗中获益。通过生物标志物去筛选有效人群成为免疫后时代重要的研究方向。本文总结了消化道肿瘤中常用的生物标志物，供大家思考，以带来治疗过程中的启示。
PD-L1的表达在消化道肿瘤的探索
目前PD-L1的表达在食管癌和胃癌临床试验中用于分层最为多见。在KEYNOTE系列当中我们可以看到PD-L1的表达CPS评分越高，免疫治疗的总生存（OS）获益更为明显。
比如KEYNOTE-180研究[1]是第一个帕博利珠单抗三线治疗晚期食管癌/胃食管结合部癌的疗效和安全性的研究。在整体人群中中位OS 5.8个月，在CPS ≥10的患者中位OS更长[6.3个月（4.4~9.3个月）vs 5.4个月（3.9~6.3个月]。
二线治疗帕博利珠单抗对比化疗的KEYNOTE-181研究[2]中，在总体人群中的OS两组没有达到统计学上的差异（7.1个月 vs 7.1个月），但是在PD-L1 CPS≥10的患者中，帕博利珠单抗显著延长了患者总生存达2.6个月（P<0.05），而且客观缓解率（ORR）在帕博利珠单抗组高达化疗组的3倍（21.5% vs 6.1%）。在亚洲人群及中国人群当中同样重复了相同的趋势。
所以根据KEYNOTE-181的结果，2019 NCCN指南已将帕博利珠单抗推荐为PD-L1 CPS≥10的晚期食管癌患者二线治疗方案。今年ESMO报道的KEYNOTE-590研究[3]比较了帕博利珠单抗联合化疗与单纯化疗一线治疗晚期食管癌患者的疗效，总体人群中2组的OS达到了统计学差异[12.4个月 vs 9.8个月， HR=0.73（0.62~0.86）]，而且在CPS≥10的患者中OS获益更好，死亡风险也下降明显（13.5个月 vs 9.4个月，HR=0.62，P<0.001）。同样在胃癌的临床试验KEYNOTE-059队列1中[4]帕博利珠单抗单药用于胃癌三线及后线治疗，PD-L1阳性（CPS>1）的患者无论是无进展生存（PFS）、ORR还是OS都高于PD-L1阴性组。
虽然KEYNOTE-061研究[5]帕博利珠单抗单抗对比紫杉醇化疗没有在PD-L1表达阳性患者中发现OS有差异，但是在CPS≥10的亚组中，帕博利珠单抗二线治疗相比紫杉醇可延长生存。
KEYNOTE-062研究[6]作为帕博利珠单抗单药或联合顺铂+5-FU一线治疗晚期胃癌或胃食管结合部癌的随机、对照、多中心Ⅲ期临床研究，帕博利珠单药组对比化疗组在CPS>1患者中达到非劣效终点，特别是CPS≥10亚组中帕博利珠单药组中位OS在数值上优于化疗组。但是联合治疗组无论是CPS≥1或≥10，帕博利珠单抗联合化疗组的OS均未优于单纯化疗组。KEYNOTE-062研究的事后分析发现，对于PD-L1 CPS≥1和CPS≥10的患者，帕博利珠单抗单药治疗在亚洲人群较总体人群的生存期更长。
针对晚期肝癌的KEYNOTE-224[7]和KEYNOTE-240[8]研究结果都表明PD-L1阳性的肝细胞癌患者疗效明显较好。整体看来在食管癌治疗中，帕博利珠单抗单药在二、三线治疗中还有一线联合化疗中PD-L1 CPS≥10的患者是绝对获益的，胃癌中帕博利珠单抗单药在一、二、三线PD-L1 CPS≥10的人群中也是优效选择，肝癌二线治疗中PD-L1阳性患者也是生存延长的。
但是同样是PD-1抑制剂，纳武利由单抗大多数情况下不需要通过PD-L1表达来筛选优势人群。比如说纳武利尤单抗 vs 化疗二线治疗晚期食管鳞癌的ATTRACTION-3研究[9]中，纳武利尤单抗组较化疗组具有更优的OS，死亡风险降低23%，中位OS改善2.5个月（10.9个月 vs 8.4个月），无论PD-L1表达都存在OS的延长。在亚洲开展的胃癌三线纳武利由单抗对比安慰剂的多中心、双盲、随机对照、Ⅲ期ATTRACTION-2研究[10]中，纳武利由单抗的OS获益同样也不受PD-L1表达状态的影响。今年ESMO公布的CheckMate 649研究[11]，纳武利尤单抗联合化疗对比化疗在PD-L1 CPS≥5、PD-L1 CPS≥1和所有随机的胃癌患者人群中都获得了统计学和临床意义的OS获益。ATTRACTION-4研究[12]中，纳武利尤单抗联合化疗组和化疗组的晚期胃癌患者PD-L1<1%的占84.0%，也可以看到中位PFS免疫联合化疗组显著优于对照组（10.45个月 vs 8.34个月，P=0.0007）。肝癌治疗中，CheckMate 040是评估纳武利由单抗一线及二线治疗晚期肝癌的Ⅲ期研究[13]，结果显示PD-L1的表达状态与ORR的获益无关。但是并不是所有的关于纳武利由单抗的疗效和PD-L1表达都无关。比如肠癌当中，REGONIVO 研究[14]中结直肠癌（CRC）队列患者根据PD-L1 CPS的PFS 在PD-L1 CPS≤1（n=8）的患者中位值为6.0个月，而 PD-L1 CPS>1（n=16）者中位PFS没有达到。虽然样本量较小，但是可以看到PD-L1 CPS评分高的似乎更能达到生存的获益。而在肝细胞癌中虽然PD-L1高表达的患者较少，但在CheckMate 459研究亚组分析也显示PD-L1阳性的患者疗效相对较好。
综上看来，PD-L1的表达和不同的PD-1抑制剂疗效之间的关系存在差异，而且PD-L1表达本身在技术层面也存在争议。目前PD-L1表达的CPS判读存在很多主观性, PD-L1免疫组化抗体众多，一致性不高。怎样读取PD-L1的表达还需进一步探索， CPS>1或5或10不一定是完美的筛选cut-off值。
肿瘤突变负荷（TMB）
TMB是近几年来比较流行的预测免疫疗效的指标，而且参与了很多重要的与免疫关联的研究。2013年Nature上展示的人类癌种基因突变中位数消化道肿瘤排在第6位（食管癌）、7位（肠癌）、10位（胃癌）、12位（肝癌）[15]。2014年最早发现高的TMB（新抗原）与黑色素瘤的免疫抑制剂（CTLA-4抑制剂）疗效相关[16]。2015年发现结肠癌错配修复缺陷（dMMR）伴高TMB的患者较错配修复正常（pMMR）伴低TMB患者对免疫抑制剂的反应好[17]。2016年自从Foundation Medcine推出商业检测TMB的基因检测Panel后，FoundationOne CDx（F1CDx）成为了首个泛瘤种伴随诊断产品。大量的研究目前明确TMB与黑色素瘤和膀胱癌免疫治疗疗效明确相关。TMB在非小细胞肺癌免疫抑制剂的疗效的预测地位此起彼伏。在消化道领域TMB预测免疫抑制剂疗效的临床研究相对较少。2018年韩国团队在55例晚期胃癌患者使用免疫抑制剂后分析发现高TMB的患者ORR为88.9%，中TMB患者的ORR为20%，低TMB患者ORR为11.1%，首次提出TMB高低与胃癌免疫治疗疗效相关[18]。
之后2019年的1月LUC G.T.Morris等人[19]分析了1662例接受免疫抑制剂的癌症患者，其中包括结肠癌（110例）和食管癌（126例）的患者，证实TMB高与接受免疫治疗后患者更好的总生存率有关，发现不同的癌种预测疗效的TMB不同，结肠癌cut-off值为52.2，食管癌为8.8。2019年中山大学徐瑞华教授团队首次提出TMB是晚期胃癌患者接受PD-1单抗（特瑞普利单抗）治疗的潜在疗效预测标志物[20]，高TMB患者（位于前20%的TMB≥12 muts/Mb）的有效率（33.3% vs 7.1%，P=0.017）及OS[14.6个月vs 4.0个月，HR=0.48（95% CI 0.24～0.96），P=0.038]均明显优于低TMB患者（TMB<12 muts/Mb）。同年发表在Clinical Cancer Research的晚期食管胃交界部肿瘤患者对免疫治疗反应的临床及分子预测指标研究发现TMB与生存率的提高相关，但排除微卫星不稳定（MSI）高的患者后没有观察到这种相关性[21]。2019年ESMO大会上公布了KEYNOTE-158[22]研究中 TMB与使用帕博利珠单抗在泛癌种的疗效相关分析，该研究纳入的患者按疾病类型包括胆道癌共10个癌种（不包括胃癌、食管、肠癌）的前瞻性研究显示肿瘤组织高tTMB水平（≥10/Mb）与经治实体瘤患者接受帕博利珠单抗单药更好的缓解率相关，研究中高tTMB患者的ORR为29%。高tTMB和非高tTMB患者的中位缓解持续时间（DoR）分别为未达到和33.1个月。所以高TMB被FDA批准可以作为帕博利珠单抗单药治疗获益的生物标志物。在晚期肠癌免疫联合治疗的CCTG CO.26 研究中[23]，度伐利尤单抗+Tremelimumab（D+T）二线及二线之后显著延长OS，但未改善PFS和ORR。高TMB（≥28 mts/Mb）患者较TMB<28患者OS获益最大：高TMB者中D+T vs 最佳支持治疗（BSC）中位OS 5.5个月 vs 3.0个月，HR=0.34；低TMB者中D+T vs BSC中位OS 6.9个月 vs 5.3个月，HR=0.76。REGONIVO 研究[24]将CRC患者根据TMB cut-off 22.55为界分组为高表达和低表达。结果发现高TMB组较低TMB组中位OS延长4.6个月（12.5个月 vs 7.9个月）。总体看来TMB似乎是胃癌、肠癌、食管癌的免疫抑制剂治疗疗效预测因子。但是因为没有一个大型的Ⅲ期临床研究来证实这一结论，都是一些小样本的探索，所以TMB在消化道肿瘤免疫治疗中的疗效预测地位始终未得到肯定。TMB本身也存在诸多问题：TMB算法不一，导致同一份样本结果不同，全外显子测序法（WES）的准确性仍需提高，且费时、昂贵，还有TMB的cut-off值的选择没有统一，不同的肿瘤当中的cut-off值不同，才能达到统计学差异。而且导致TMB高背后的因素很多，包括微卫星不稳定，包括伴有POLE/POLD突变[25]、还有RRM1、TP53、FANCE、NEIL1、POLG、FANCE、GEN1、RPA1等基因突变。所以探索TMB这个表象背后的故事也可以为免疫治疗疗效预测提供一定方向。
微卫星高度不稳定（MSI-H/dMMR）
MSI-H最早在家族肠癌患者中发现[26]，后来发现MSI也存在于其他类型的肿瘤当中。但是MSI-H人群的比例不高，子宫内膜癌最高达15%~20%，其次肠癌中占比为5%左右，胃癌排在其后，肝癌和食管癌发生概率不足2%[27]。最早于2015年发表在《新英格兰医学杂志》的KEYNOTE-016[17]和CheckMate 142的研究[28]奠定了MSI与免疫抑制剂治疗的抗肿瘤疗效相关。KEYNOTE-164结果[29]进一步确认了帕博利珠单抗在经治MSI-H/dMMR转移性结直肠癌患者的持久临床获益。后基于KEYNOTE-158的结果[30]，MSI-H/dMMR实体瘤患者成为使用帕博利珠单抗的准确目标人群。今年KEYNOTE-177重磅研究[31]结果证实了dMMR晚期肠癌免疫治疗较化疗延长生存1倍以上，坐实了MSI-H作为疗效预测标志物的地位。应该说MSI-H是在消化道肿瘤里比较普遍接受及认可的用于预测疗效的良好的生物标志物。
除了上述常见的生物标志物，仍然有很多的潜在标志物有探索的空间，包括肿瘤的炎性状态TIL等，还有HLA、EBV感染等。但是由于免疫微环境的复杂性，单纯一个指标不足以完全预测免疫抑制剂疗效和患者预后。特别是在消化道肿瘤里，喜忧参半，同一个生物标物标志物也在不同的抑制剂中和不同的癌种当中有不同的预测结果，特别在肝癌当中更是很难找到合适的标志物去预测疗效。总而言之，生物标志物可以协助判断预测治疗的有效性，但是需要进一步前瞻性研究来验证。
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