低蛋白饮食 尼古丁皮下注射和自然选择形成的胎儿生长受限大鼠模型胎盘细胞凋亡研究
作者姓名：肖超群1，谢晓珍1，2，王志坚1
作者单位：1. 南方医科大学南方医院妇产科;2. 南方医科大学附属佛山市妇幼保健院
基金项目：国家自然科学基金（81971415）；广东省医学科学技术研究基金（C2018065）；2018年南方医院院长基金（2018B004）
摘要：目的 探讨低蛋白饮食喂养、尼古丁皮下注射及自然选择3种方法形成的胎儿生长受限（FGR）大鼠模型胎盘细胞凋亡情况及所致大鼠FGR可能的致病机制。方法 2018年6月至2019年1月于南方医科大学南方医院动物实验中心将26只Wistar雌鼠随机分为非干预组（n=14）、低蛋白饮食组（n=6）和尼古丁注射组（n=6）。非干预组大鼠正常饲养，低蛋白饮食组及尼古丁注射组分别采用相应干预手段建立FGR模型。非干预组共获子鼠132只，有12只出生体重低于同组平均体重2个标准差的FGR弱仔，收集弱仔胎盘作为研究组1（自然选择组）；低蛋白饮食组共获子鼠67只，其中FGR弱仔20只，随机选择18只弱仔胎盘作为研究组2（低蛋白饮食组）。尼古丁注射组共获子鼠60只，其中FGR弱仔21只，随机选择18只弱仔胎盘作为研究组3（尼古丁注射组）。在非干预组随机选择42只适龄幼仔胎盘作为正常对照组。采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）染色检测各组胎盘细胞凋亡率，逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检测细胞凋亡因子（Bax、Bcl-2、p53、Fas和Fas-L）mRNA表达水平，免疫组织化学染色检测蛋白表达水平。结果 低蛋白饮食和尼古丁皮下注射均成功建立FGR大鼠模型，其FGR发生率明显高于非干预组（正常对照组）（29.89%，35% vs. 9.09%，P＜0.05）。自然选择组和尼古丁注射组胎盘细胞凋亡率均显著高于正常对照组［（66.120±14.611）%，（73.046±13.666）% vs.（28.740±27.184）%，P＜0.01］；低蛋白饮食组胎盘细胞凋亡率稍高于正常对照组，差异无统计学意义。与正常对照组相比，研究组1中Bcl-2、Fas-L表达水平显著降低［mRNA表达水平：Bcl-2（0.257±0.043）vs.（1.000±0.260），P＜0.01；Fas-L（0.285±0.065）vs.（1.000±0.196），P＜0.01；蛋白表达水平：Bcl-2 34.60 vs. 54.63，P＜0.01；Fas-L 31.93vs. 64.65，P＜0.01］；研究组2中Bcl-2、Fas-L表达水平显著降低［mRNA表达水平：Bcl-2（0.261±0.029）vs.（1.000±0.260），P＜0.01；Fas-L（0.423±0.032）vs.（1.000±0.196），P＜0.01；蛋白表达水平：Bcl-2 40.05 vs. 54.63，P＜0.01；Fas-L 32.45vs. 64.65，P＜0.01］；p53表达水平显著升高［mRNA表达水平：（1.433±0.151）vs.（1.000±0.242），P＜0.01；蛋白表达水平：48.00vs. 29.10，P＜0.01］；研究组3中Bax、p53、Fas表达水平显著升高［mRNA水平：Bax（1.438±0.177）vs.（1.000±0.113），P＜0.01；p53（2.176±0.356）vs.（1.000±0.0.242），P＜0.01；Fas（1.335±0.076）vs.（1.000±0.090），P＜0.01；蛋白表达水平：Bax52.10 vs. 36.45，P＜0.05；p53 52.90 vs. 29.10，P＜0.01；Fas 49.03 vs. 30.35，P＜0.05］；Bcl-2、Fas-L表达水平显著降低［mRNA水平：Bcl-2（0.213±0.024）vs.（1.000±0.0.260，P＜0.01）；Fas-L（0.503±0.100）vs.（1.000±0.0.196），P＜0.01；蛋白表达水平：Bcl-2 32.73 vs. 54.63，P＜0.01；Fas-L 32.98 vs. 64.65，P＜0.01］。结论 3种因素所致大鼠FGR胎盘细胞凋亡率均显著升高，说明胎盘细胞凋亡与FGR形成存在关系。低蛋白饮食、尼古丁及自然因素所致FGR大鼠胎盘细胞凋亡途径、凋亡相关因子各不相同，说明不同因素诱发FGR的机制也不完全一致。
关键词：胎儿生长受限；围产期；大鼠FGR模型；胎盘细胞凋亡
胎儿生长受限（fetal growth restriction，FGR）与多种不良围产结局有关［1-2］。目前，针对不同因素导致FGR的发病机制研究逐渐涉及胎盘细胞过度凋亡、凋亡/增殖比例失衡［3］，但不同建模方法所测胎盘凋亡相关因子表达水平相差较大。有关特发性FGR的胎盘细胞凋亡研究主要集中在胎盘大体分析和妊娠结局多样性评估，营养不良法和毒物法制作的FGR胎盘细胞研究仅少数对Bax、Bcl-2、p53、Fas和Fas-L进行了单个或多个凋亡因子转录或翻译水平的研究［4］。未见有关营养不良或有毒物质导致FGR与自然发生FGR胎盘细胞凋亡情况的比较研究。为解决这一问题，本研究采用低蛋白饮食喂养、尼古丁皮下注射及自然选择法建立3种FGR大鼠模型并对比其胎盘细胞凋亡率、凋亡相关因子转录和翻译水平的异同，探讨3种不同因素所致大鼠FGR的可能致病机制异同。现将结果报道如下。
1 资料与方法
1.1 实验动物 2018年6月至2019年1月于南方医科大学南方医院动物实验中心购入健康成熟未育Wistar大鼠35只，其中雌鼠26只（体重220～250g），雄鼠9只（280～330g）。饲养条件为室温，湿度60%～80%，正常昼夜交替，不限食水，每周定期更换垫料。
1.2 分组及大鼠FGR模型建立 雌雄大鼠分笼适应性饲养1周后，雌鼠阴道分泌物涂片镜检为动情期者予合笼处理：每日18∶00按雌、雄比例3∶1合笼，次日8∶00行雌鼠阴道分泌物涂片美蓝染色镜检，精子阳性者定为妊娠第0.5天（gestational day 0.5，GD 0.5）。精子阴性者继续原方法合笼至阳性检出。随机选择14只孕鼠设为非干预组，予普通大鼠饲料（蛋白含量20%）喂养；随机选择6只孕鼠设为低蛋白饮食组，予低蛋白大鼠饲料（蛋白含量8%）喂养，6只孕鼠设为尼古丁注射组，予普通大鼠饲料（蛋白含量20%）喂养，妊娠第12.5天予2mg/kg剂量尼古丁皮下注射。
3组孕鼠均于妊娠第19.5天剖宫取胎留取胎鼠及胎盘组织，子鼠称重，以非干预组子鼠平均出生体重减去该组标准差的2倍为标准，小于或等于此标准的子鼠定义为FGR弱仔，大于此标准者定义为适龄幼仔。留取3组弱仔胎盘作为研究组，以适龄幼仔胎盘作为正常对照组。
1.3 检测方法 （1）胎盘取材：新鲜胎盘组织2/3置于10%中性甲醛固定24h，做成石蜡块；1/3经生理盐水脐静脉灌注冲洗后置于-80℃冰箱用于RNA提取（2）胎盘细胞凋亡率测定：每个蜡块取3张4μm切片后置于BX63全自动智能荧光显微镜高倍镜视野下，按“弓”字形不重叠摄片，以细胞核出现棕色颗粒为增殖细胞核抗原（PCNA）表达阳性，以细胞凋亡率（AI）=阳性细胞数/细胞总数×100%为量化指标，对比3个研究组与正常对照组胎盘细胞凋亡水平的差异（3）凋亡因子（Bax、Bcl-2、p53、Fas和Fas-L）mRNA表达水平采用逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检测（4）凋亡因子（Bax、Bcl-2、p53、Fas和Fas-L）蛋白表达水平采用免疫组织化学染色检测半定量分析。免疫组织化学染色半定量评分标准见表1。
1.4 统计学分析 采用SPSS 21.0统计软件，数据资料用均数±标准差表示，各因子表达组间差异性比较采用One-Way ANOVA检验（LSD-t检验，Dunnett’s T3检验）进行显著性分析；计数资料组间差异性比较采用非参数检验进行显著性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。所有统计学柱状图均采用GraphPad Prism6软件作图。
2 结果
2.1 一般情况 非干预组共获子鼠132只，有12只弱仔，收集胎盘作为研究组1（自然选择组）；低蛋白饮食组共获子鼠67只，其中FGR弱仔20只，随机选择18个弱仔胎盘作为研究组2。尼古丁注射组共获子鼠60只，其中FGR弱仔21只，随机选择18个弱仔胎盘作为研究组3。在非干预组随机选择42个适龄幼仔胎盘作为正常对照组。
非干预组子鼠平均出生体重为（2.40±0.29）g，低蛋白饮食组子鼠平均出生体重为（2.22±0.30）g，尼古丁注射组子鼠平均出生体重为（2.19±0.29）g，低蛋白饮食组、尼古丁注射组子鼠平均出生体重显著低于非干预组，差异有统计学意义（P＜0.05，见图1a）。低蛋白饮食组、尼古丁注射组子代FGR发生率显著高于非干预组，差异具有统计学意义（29.89%，35% vs. 9.09%，P＜0.05，见图1b），3组中尼古丁注射组子代FGR发生率最高。
2.2 正常对照组、自然选择组、低蛋白饮食组及尼古丁注射组胎盘细胞凋亡情况
2.2.1 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）染色结果 正常对照组、自然选择组、低蛋白饮食组及尼古丁注射组大鼠胎盘基底层胎盘细胞凋亡率均较迷路层胎盘细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01，见图2～3）。
2.2.2 研究组大鼠胎盘细胞凋亡率与正常对照组比较 自然选择组、尼古丁注射组胎盘细胞凋亡率较正常对照组显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；低蛋白饮食组胎盘细胞凋亡率较正常对照组稍高，差异无统计学意义（P=0.091，见表2）。
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2.2.3 各研究组大鼠胎盘细胞凋亡率组间比较 尼古丁注射组胎盘细胞凋亡率较低蛋白饮食组显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；自然选择组胎盘细胞凋亡率较低蛋白饮食组显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；尼古丁注射组胎盘细胞凋亡率较自然选择组显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。3组中低蛋白饮食组胎盘细胞凋亡率最低，尼古丁注射组胎盘细胞凋亡率最高。
2.3 正常对照组与各研究组Bax、Bcl-2、p53、Fas及Fas-L的mRNA和蛋白表达水平比较
2.3.1 mRNA水平 与正常对照组相比，自然选择组胎盘细胞凋亡的线粒体途径中：Bax、p53 mRNA表达水平差异不显著；Bcl-2 mRNA表达水平显著下调，差异有统计学意义（P＜0.01）。胎盘细胞凋亡的死亡受体途径中：Fas mRNA表达水平显著下调，差异有统计学意义（P＜0.01）；Fas-L mRNA表达水平显著下调，差异有统计学意义（P＜0.01）。
与正常对照组相比，低蛋白饮食组胎盘细胞凋亡的线粒体途径中：Bax mRNA表达水平差异不显著；Bcl-2 mRNA表达水平显著下调，差异有统计学意义（P＜0.01）；p53 mRNA表达水平显著上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。胎盘细胞凋亡的死亡受体途径中：Fas mRNA表达水平差异不显著；Fas-L mRNA表达水平显著下调，差异有统计学意义（P＜0.01）。
与正常对照组相比，尼古丁注射组胎盘细胞凋亡的线粒体途径中：Bax、p53 mRNA表达水平显著上调，Bcl-2 mRNA表达水平显著下调，差异均有统计学意义（P均＜0.01）。胎盘细胞凋亡的死亡受体途径中：Fas mRNA表达水平显著上调，差异有统计学意义（P＜0.05）；Fas-L mRNA表达水平显著下调，差异有统计学意义（P＜0.01）。与正常对照组相比，自然选择组、低蛋白饮食组及尼古丁注射组Bcl-2/Bax比值均下降；自然选择组、低蛋白饮食组及尼古丁注射组Fas/Fas-L比值均上升。见表3～4。
2.3.2 蛋白表达水平 与正常对照组相比，自然选择组胎盘细胞凋亡的线粒体途径中：Bax蛋白表达水平差异不显著（见图4a、4d）；Bcl-2蛋白表达水平显著下调，差异有统计学意义（34.60 vs. 54.63，P＜0.01，见图4b、4e）；p53蛋白表达水平略上调，差异无统计学意义（见图4c、4f）。细胞凋亡死亡受体途径中：Fas蛋白表达水平显著上调，差异有统计学意义（见图5a、5c）（49.75 vs.30.35，P＜0.05）；Fas-L蛋白表达水平显著下调，差异有统计学意义（见图5b、5d）（31.93 vs. 64.65，P＜0.01）。
与正常对照组相比，低蛋白饮食组胎盘细胞凋亡的线粒体途径中：Bax蛋白表达水平差异不显著（见图4a，4g）；Bcl-2蛋白表达水平显著下降，差异有统计学意义（见图4b、4h）（40.05 vs.54.63，P＜0.01）；p53蛋白表达水平显著上升，差异有统计学意义（见图4c、4i）（48.00 vs. 29.10，P＜0.01）。胎盘细胞凋亡的死亡受体途径中：Fas蛋白表达水平差异不显著（见图5a、5e）；Fas-L蛋白表达水平显著下降，差异有统计学意义（见图5b，5f）（32.45 vs.64.65，P＜0.01）。
与正常对照组相比，尼古丁注射组胎盘细胞凋亡的线粒体途径中：Bax蛋白表达水平显著上升，差异有统计学意义（见图4a、4j）（52.10 vs.36.45，P＜0.05）；Bcl-2蛋白表达水平显著下调，差异有统计学意义（见图4b、4k）（32.73 vs. 54.63，P＜0.01）；p53蛋白表达水平显著上调，差异有统计学意义（见图4c、4l）（52.90 vs.29.10，P＜0.01）。胎盘细胞凋亡的死亡受体途径中：Fas蛋白表达水平显著上调，差异有统计学意义（见图5a、5g）（49.03 vs. 30.35，P＜0.05）；Fas-L蛋白表达水平显著下调，差异有统计学意义（见图5b、5h）（32.98 vs.64.65，P＜0.01）。
3 讨论
细胞凋亡作为维系器官细胞正常新陈代谢和器官正常生理功能的生物学现象，贯穿于胎盘发育的整个过程。早孕期细胞生长大于细胞凋亡，有利于胎盘发育和胎儿生长；随着妊娠时间延长，凋亡不断增加，有利于胎盘成熟和胎儿娩出。胎盘细胞增殖与凋亡的动态平衡是维持正常胎盘功能的必要条件，凋亡异常将引起胎盘功能障碍和病理妊娠发生。越来越多研究证实胎盘结构发育不良和（或）功能障碍与大部分“胎盘源性疾病”密切相关，FGR就是其中一种“胎盘源性疾病”。FGR的发生与胎盘细胞的过度凋亡、凋亡/增殖比例失衡密切相关［5］。
细胞凋亡有半胱氨酸蛋白（半胱天冬酶）依赖性和非半胱天冬酶依赖性两大途径，非半胱天冬酶依赖性途径很少。半胱天冬酶依赖性途径又分为细胞外死亡受体途径（通过细胞膜上死亡受体激活半胱天冬酶）和细胞内线粒体途径（通过细胞内线粒体释放凋亡因子激活半胱天冬酶），这两个途径是公认的胎盘细胞凋亡的主要途径［6］。Fas是介导凋亡的细胞表面受体，存在于T淋巴细胞为主的多种细胞中。Fas-L是Fas配体，与Fas结合向细胞内传递死亡信息。Fas/Fas-L是细胞外凋亡途径的起始因子及主要受体/配体［7］。妊娠期间母体内异体抗原激活的大量T淋巴细胞需要通过Fas/Fas-L介导的细胞凋亡失活，以保护胎儿的生长发育［8］。Bax和Bcl-2基因是调控线粒体途径细胞凋亡的重要基因，Bax促进凋亡，Bcl-2抑制凋亡。Bax和Bcl-2基因的异常表达可打破滋养细胞“抑制-促进”平衡，使胎盘细胞过度凋亡，影响胎儿生长发育［9］。p53引起细胞凋亡的途径比较复杂，既可以通过细胞受体通路也可以通过线粒体通路引起细胞凋亡。
目前，已有一些有关FGR胎盘细胞凋亡的研究，但多集中在特发性FGR及妊娠并发症引起的FGR，未见针对营养因素及有毒物质引起FGR的胎盘细胞凋亡研究。研究方法上多为针对死亡受体或线粒体单个途径变化对胎盘功能影响，很少有多种细胞凋亡因子共同研究的报道。研究结果也存在差异，Whitehead等［10］通过对比早发型重度FGR胎盘和正常妊娠胎盘细胞凋亡率发现，细胞内线粒体途径中Bcl-2基因显著上调，认为是导致胎盘细胞凋亡率上升和FGR发生的主要原因。而Lappas等［6］通过临床标本和动物模型对比特发性FGR胎盘和正常妊娠胎盘细胞凋亡率发现Bax、p53基因明显上调，未见Bcl-2基因表达水平改变。这些研究结果的差异具体原因不明。我们推测，不同原因所致FGR胎盘细胞凋亡相关因子表达可能不完全相同。为验证这一假设，我们利用营养干预、尼古丁皮下注射和自然筛选方法建立3种FGR大鼠模型，研究模型胎盘细胞中细胞凋亡相关基因表达情况。
本研究结果显示，3种FGR模型胎盘细胞凋亡率与正常胎盘相比均升高，说明3种不同因素所致FGR均与胎盘细胞凋亡有关。其中尼古丁注射组胎盘细胞凋亡率最高，自然选择组次之，低蛋白饮食组最低，3种FGR组胎盘细胞凋亡率两两比较，差异均有统计学意义。说明本实验所建立3种FGR大鼠模型诱导胎盘细胞凋亡程度不完全一致，可能与细胞凋亡发生的途径或作用因子不完全一致有关。本研究中各组FGR大鼠胎盘基底层和迷路层细胞均存在细胞凋亡，主要集中在胎盘基底层，与Furukawa等［11］的动物实验结果相一致。
对比研究组和正常对照组胎盘细胞凋亡相关基因mRNA和蛋白表达水平，结果显示自然选择组中Bcl-2显著下调，Bax无明显变化，Bcl-2/Bax比值下降由Bcl-2变化导致；Fas-L显著下降、Fas显著上升，Fas/Fas-L比值升高与两个基因变化均明显相关，说明自然选择组的细胞凋亡途径以细胞膜受体途径为主，线粒体途径为辅。低蛋白饮食组中Bcl-2显著下调、Bax无明显变化，Fas-L显著下降、Fas 无明显变化，p53有升高，说明两个细胞凋亡途径在低蛋白饮食组细胞凋亡中均起一定作用，但作用强度较弱，也无优势之分。尼古丁注射组Bcl-2、Bax、p53、Fas、Fas-L 5个基因 mRNA及其相应转录蛋白表达均显著变化，Bcl-2/Bax比值明显下降，Fas/Fas-L比值明显上升，说明两条凋亡途径在该组细胞凋亡中均起到较强作用。这也是3个研究组中低蛋白饮食组胎盘细胞凋亡率最低、尼古丁注射组胎盘细胞凋亡率最高、低蛋白饮食组胎盘细胞凋亡率与正常对照组差异无显著意义的原因。由此证实不同因素引起的FGR虽然都有胎盘细胞凋亡，细胞膜受体途径和线粒体途径在胎盘细胞凋亡中均起作用，但各途径起作用强度不同，主要作用途径也不完全相同。
本研究通过低蛋白饮食喂养、皮下注射尼古丁及自然选择建立3种FGR大鼠模型，通过对比胎盘细胞凋亡率、凋亡相关因子转录和翻译水平的差异，明确了不同因素导致的FGR均与胎盘细胞凋亡增加有关，但所作用的胎盘细胞凋亡途径以及其中相关凋亡因子的调节各不相同。推测不同致病因素诱导产生FGR的细胞凋亡途径、凋亡相关因子不完全一致，诱导产生FGR子代的发生机制也不完全一致，机制的具体相关环节有待进一步研究。
参考文献 略
